鄭 藝,胡 芃,張洪波,吳愛林,康亞輝,詹必紅

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院西區(qū),安徽省腫瘤醫(yī)院腫瘤放射治療科,合肥 230001;*通訊作者,E-mail:534116872@qq.com)

肺癌是目前全世界具有較高發(fā)病率和死亡率且對(duì)人群健康和生命產(chǎn)生重大威脅的惡性腫瘤之一,而其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占據(jù)了80%-85%[1,2]。NSCLC早期癥狀不明顯,一經(jīng)診斷,70%左右患者已經(jīng)進(jìn)入中晚期,失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。目前針對(duì)中晚期NSCLC,放射治療或化放療聯(lián)合治療是其主要治療手段,但其總體預(yù)后較差,5年生存率較差[3]。同時(shí)高劑量的放射治療有可能給患者帶來(lái)較嚴(yán)重的并發(fā)癥,且某些類型的肺癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性較低甚至出現(xiàn)放射抵抗,從而使放療的作用大大降低。因此,研究如何增加NSCLC的放射治療效應(yīng)在臨床上有著重要意義。B細(xì)胞易位基因2(B cell translocation gene 2,BTG2)是抗增殖基因家族的一個(gè)瞬時(shí)早期反應(yīng)基因,在多種組織和器官中均有表達(dá),是公認(rèn)的腫瘤抑制基因,同時(shí)也是DNA損傷細(xì)胞反應(yīng)通路中p53依賴性的成分之一[4,5]。放療射線對(duì)細(xì)胞的損傷可通過直接作用于DNA分子,導(dǎo)致DNA鏈斷裂[6],目前BTG2對(duì)NSCLC放療敏感性影響的研究很少。本研究通過分析數(shù)據(jù)庫(kù)中臨床NSCLC患者腫瘤樣本中BTG2的表達(dá)情況,分析BTG2表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性,探討B(tài)TG2對(duì)NSCLC放療敏感性的影響及其可能機(jī)制,為NSCLC的放射治療相關(guān)靶基因的研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

噻唑藍(lán)(5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。攜帶無(wú)意義序列的陰性對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1-HA和攜帶BTG2的HA-BTG2質(zhì)粒購(gòu)自通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司。LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。BTG2(ab197362)、P53(ab32389)、BRCA1(ab238983)蛋白抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,GAPDH(AP0066)抗體購(gòu)自南京巴傲德生物科技有限公司。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢BTG2在NSCLC中的表達(dá)情況

通過使用Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),查詢BTG2蛋白在不同腫瘤中的表達(dá)水平,同時(shí)分析統(tǒng)計(jì)BTG2蛋白在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)水平。通過TIMER:Tumor IMmune Estimation Resource數(shù)據(jù)庫(kù)和Kaplan-Meier Plotter的分析方法對(duì)BTG2水平與NSCLC患者術(shù)后生存率關(guān)系進(jìn)行研究。

1.3 細(xì)胞株、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞分組

人肺腺癌細(xì)胞系H1975和人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù),胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。兩株細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,37 ℃且含有5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在檢測(cè)BTG2對(duì)H1975細(xì)胞增殖及對(duì)放射敏感性時(shí),H1975細(xì)胞分為:對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HA空載質(zhì)粒)和過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染HA-BTG2質(zhì)粒)。在探尋BTG2增強(qiáng)H1975細(xì)胞放療敏感性的可能機(jī)制時(shí),H1975細(xì)胞分為:對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HA空載質(zhì)粒)、過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染HA-BTG2質(zhì)粒)、照射組(轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HA空載質(zhì)粒+X射線4 Gy照射)和聯(lián)合組(轉(zhuǎn)染HA-BTG2質(zhì)粒+X射線4 Gy照射)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d,將胰酶消化后的H1975細(xì)胞按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞在6孔板中進(jìn)行鋪板,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。對(duì)于每孔細(xì)胞,使用200 μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋2 μg質(zhì)粒DNA,混勻,靜置5 min;使用200 μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋4 μl LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑,混勻,靜置5 min;將稀釋的DNA和稀釋的轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻,室溫孵育20 min。6孔板中棄去培養(yǎng)基,加入1.6 ml的只含有10%血清的培養(yǎng)基和DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物,輕搖培養(yǎng)板使其混勻,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24-48 h。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1975細(xì)胞制成終濃度為7.5×104/ml的單細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,100 μl/孔,37 ℃,5% CO2,在飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h。分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HA和HA-BTG2質(zhì)粒,繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72,96 h,加入15 μl的MTT溶液(5 mg/ml)。4 h后仔細(xì)地吸去上清,每孔加入150 μl二甲基亞砜(dimethylsulphoxide,DMSO),震蕩器震蕩待甲臜完全溶解,30 min后在490 nm波長(zhǎng)處用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)吸光度值(OD490)。重復(fù)3次取平均值。檢測(cè)BTG2對(duì)放療的增敏作用時(shí),細(xì)胞在完成轉(zhuǎn)染24 h后分別采用不同劑量X射線(0,1,2,4,8 Gy)照射一次,并繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,按上述操作通過MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。

1.6 Western blot檢測(cè)BTG2、P53和BRCA1蛋白表達(dá)變化

將經(jīng)過處理后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中,1 500 r/min離心5 min,棄上清,加入適量細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min,12 000 r/min離心10 min獲得蛋白樣品。BCA法檢測(cè)各組蛋白樣品濃度,各組上樣體積為30 μg,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,牛奶封閉1 h后TBST清洗3次,6 min/次;一抗(BTG2,1 ∶1 000;P53,1 ∶1 000;BRCA1,1 ∶1 500;GAPDH,1 ∶5 000)過夜低溫孵育;二抗(Goat anti-Rabbit IgG H & L-HRP;1 ∶50 000)室溫孵育1 h,ECL化學(xué)發(fā)光法置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照,并通過Image J軟件進(jìn)行灰度值掃描分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)描述用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間差異比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn),多組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BTG2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)譜分析

Tumor IMmune Estimation Resource、Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果表明BTG2在NSCLC中mRNA的表達(dá)量較正常組織中明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

圖1 不同數(shù)據(jù)庫(kù)分析BTG2在癌旁組織和肺癌組織中的表達(dá)量Figure 1 Expression of BTG2 in adjacent tissues and NSCLC tissues in various databases

2.2 BTG2基因蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系

數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明BTG2低表達(dá)的NSCLC患者總體生存時(shí)間要低于BTG2高表達(dá)的患者(P<0.05,見圖2)。

A.TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中NSCLS患者生存率比較B.Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中NSCLS患者生存率比較圖2 NSCLC患者BTG2高表達(dá)與低表達(dá)組生存率的比較Figure 2 Comparison of survival rate in NSCLC patients between BTG2 high expression group and BTG2 low expression group

2.3 BTG2對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B相比,人肺腺癌細(xì)胞系H1975中BTG2的表達(dá)明顯降低(P<0.05,見圖3)。H1975細(xì)胞中過表達(dá)HA-BTG2質(zhì)粒構(gòu)建成功(見圖4)。MTT結(jié)果顯示,H1975細(xì)胞中過表達(dá)BTG2抑制了NSCLC細(xì)胞的增殖,在培養(yǎng)48,72,96 h時(shí)各過表達(dá)組與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。表明過表達(dá)BTG2可以顯著抑制NSCLC細(xì)胞H1975的增殖能力。

與BEAS-2B細(xì)胞相比,***P<0.001圖3 BTG2在BEAS-2B和H1975細(xì)胞中的表達(dá)情況Figure 3 Expression of BTG2 in BEAS-2B and H1975 cells

與對(duì)照組相比,***P<0.001圖4 H1975細(xì)胞中過表達(dá)HA-BTG2后驗(yàn)證BTG2的表達(dá)Figure 4 Verification of BTG2 expression in H1975 cells after the overexpression of HA-BTG2

與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖5 過表達(dá)HA-BTG2對(duì)H1975細(xì)胞增殖的影響Figure 5 Effects of BTG2 on the proliferation of NSCLC cell

2.4 BTG2對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放療增敏作用

MTT結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比較,在經(jīng)過不同劑量X射線照射后,過表達(dá)組H1975細(xì)胞的增殖活性明顯減弱。當(dāng)照射劑量為4 Gy時(shí),對(duì)照組和過表達(dá)組H1975細(xì)胞的OD值分別為0.85±0.03和0.64±0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。

與對(duì)照組相比,**P<0.01,***P<0.001圖6 BTG2過表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞放射治療后增殖的影響Figure 6 Effects of BTG2 overexpression on the proliferation of NSCLC cells after radiotherapy

表明BTG2對(duì)NSCLC細(xì)胞具有放療增敏作用。

2.5 BTG2通過調(diào)控NSCLC細(xì)胞DNA損傷修復(fù)作用增強(qiáng)放療敏感性

Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,過表達(dá)組P53蛋白表達(dá)增加,BRCA1蛋白表達(dá)降低(P<0.05);照射組BRCA1蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低(P<0.05)，而對(duì)P53幾乎無(wú)影響(P>0.05)。與照射組和過表達(dá)組相比,聯(lián)合組H1975細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)明顯升高,BRCA1蛋白表達(dá)降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖7)。

與對(duì)照組比較，**P<0.01；與照射組相比,###P<0.001圖7 BTG2和X射線聯(lián)用對(duì)H1975細(xì)胞中P53和BRCA1蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effects of BTG2 and X-ray exposure on the expression of P53 and BRCA1 proteins in H1975 cells

3 討論

近年來(lái),肺癌成為我國(guó)發(fā)生率和死亡率第一位的惡性腫瘤,其中約85%的患者為NSCLC,目前NSCLC的治療手段主要包括手術(shù)治療、化療和放射治療,但大多數(shù)NSCLC患者在確診時(shí)就已經(jīng)失去了手術(shù)的機(jī)會(huì),因此放射治療在NSCLC治療中尤為重要,尤其是中晚期患者[7,8]。在這個(gè)過程中,NSCLC患者通常會(huì)伴有不同程度的放療不敏感即放療抵抗,極大程度地限制了腫瘤放射治療的效果[9]。放療抵抗的產(chǎn)生是一個(gè)多基因、多因子和多機(jī)制共同參與的過程。放療射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的損傷作用分為兩種:一種是直接損傷,射線直接作用在DNA分子上使其DNA單鏈或雙鏈的斷裂交叉;另一種是間接損傷,射線能夠?qū)颊呷梭w組織內(nèi)的水產(chǎn)生電離作用從而產(chǎn)生毒性自由基,繼而對(duì)DNA等生物大分子發(fā)揮作用給腫瘤細(xì)胞帶來(lái)不可逆的損傷[10]。因此,在NSCLC治療過程中增強(qiáng)患者對(duì)放療的敏感性有著重要的臨床意義。

BTG/TOB基因家族是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抗增殖基因家族,被發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)控基因表達(dá)等方面都扮演著重要角色[5]。BTG2作為該家族第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的基因,大量研究表明,BTG2在多種組織和器官中均有表達(dá),參與了細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等多種生物學(xué)活動(dòng)[11]。近期大量研究報(bào)道BTG2在腫瘤中的表達(dá)水平與腫瘤的生物學(xué)特性緊密相關(guān),被認(rèn)為是腫瘤抑制基因,在肝癌[12]、膀胱癌[13]、乳腺癌[14]、卵巢癌[15]等腫瘤中呈表達(dá)顯著減少甚至不表達(dá)的現(xiàn)象,并且影響腫瘤患者的生存質(zhì)量和預(yù)后情況。Zhang等[16]報(bào)道,當(dāng)細(xì)胞受到刺激因子作用繼而發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí),BTG2會(huì)通過抑制Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄從而降低其蛋白水平,誘導(dǎo)細(xì)胞在G1/S期停滯,起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。同時(shí),BTG2結(jié)構(gòu)中從-74到-122區(qū)域存在著野生型p53基因反應(yīng)元件,Cortes等[17]研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在受到紫外線照射后,出現(xiàn)DNA損傷,P53蛋白表達(dá)顯著增加的同時(shí)伴隨著BTG2蛋白表達(dá)上調(diào),表明BTG2在射線導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)過程中可能發(fā)揮重要作用。毛必靜等[18]在肝癌中發(fā)現(xiàn)P53可以直接上調(diào)BTG2的表達(dá),且能夠抑制Cyclin D1和Cyclin E的蛋白表達(dá)。在DNA處于受損狀態(tài)時(shí),P53蛋白上調(diào),使得細(xì)胞周期阻滯在G1/S期,DNA開始修復(fù)損傷。在此過程中,BTG2可以通過增加DNA損傷關(guān)鍵蛋白MRE11的甲基化和蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMTs的活性來(lái)加速DNA的修復(fù)過程。DNA的損傷修復(fù)是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生放射抵抗的重要原因之一,腫瘤細(xì)胞對(duì)于電離輻射的敏感性在很大程度上取決于DNA鏈斷裂程度及其自身的損傷修復(fù)能力。DNA損傷修復(fù)機(jī)制主要包括同源重組和非同源末端連接,而BRCA1蛋白直接參與這兩個(gè)過程,其表達(dá)下調(diào)能夠減少斷裂DNA雙鏈的修復(fù)并誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡[19]。研究表明BTG2和BRCA1兩種蛋白可以形成蛋白-蛋白復(fù)合物,以負(fù)反饋調(diào)控的形式來(lái)共同調(diào)節(jié)DNA的損傷修復(fù)過程[20]。目前已有研究[20]發(fā)現(xiàn)各種DNA損傷如UV照射和電離輻射照射等刺激后都可以直接誘導(dǎo)BTG2的表達(dá)和功能活化,以上結(jié)果均表明BTG2可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性,但目前BTG2在NSCLC放療過程中的作用和機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究中,我們通過查閱多種數(shù)據(jù)庫(kù)[21,22]并進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),BTG2在肺癌的腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織,且BTG2低表達(dá)時(shí)腫瘤患者的預(yù)后較差。同樣,NSCLC細(xì)胞中BTG2的表達(dá)顯著低于正常肺上皮細(xì)胞中BTG2表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)BTG2可以顯著抑制NSCLC細(xì)胞H1975的增殖能力,且能明顯增強(qiáng)H1975細(xì)胞對(duì)于X射線的放療敏感性。與照射組相比,聯(lián)合組能夠在進(jìn)一步上調(diào)P53表達(dá)的同時(shí)下調(diào)BRCA1的表達(dá)。綜上所述,BTG2在NSCLC中可能是通過上調(diào)P53的表達(dá)、降低BRCA1的表達(dá)來(lái)干擾DNA的損傷修復(fù)過程,進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞的增殖,為臨床NSCLC的治療提供參考。