沈欽華,李素娟,董蘇一

(武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院藥劑科,武漢 430040;*通訊作者,E-mail:271057832@qq.com)

流感是一種急性病毒性呼吸系統(tǒng)疾病,嚴(yán)重時(shí)可引起肺炎甚至呼吸衰竭,在全球范圍內(nèi)具有高發(fā)病率和高死亡率[1]。甲型流感病毒(IAV)感染是其主要致病因素,具有強(qiáng)烈的傳染性、快速的流行性和變異性[2]。目前臨床治療方法僅限于疫苗和一些抗病毒藥物,但是長期大量使用藥物具有較大的毒副性,還可增加病毒的抗藥性[3]。因此,開發(fā)高效、低毒的抗流感藥一直受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。近年來不少研究發(fā)現(xiàn)中藥在流感病毒的防治上發(fā)揮重要作用,黃芪是我國一味常用的傳統(tǒng)中藥,具有悠久的臨床應(yīng)用歷史,黃芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)是從黃芪中提取的一種水溶性雜多糖,具有多種藥理作用,包括調(diào)節(jié)免疫[4]、抗炎[5]、抗腫瘤[6]和抗病毒[7]等。研究發(fā)現(xiàn)APS對(duì)流感病毒感染的小鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用,可降低肺組織的炎性反應(yīng),緩解肺炎性病理損傷[7,8];但其作用機(jī)制尚不完全明確。近來發(fā)現(xiàn)NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小體與多種肺部炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系[9,10]。研究證實(shí)IAV可激活NLRP3炎癥小體并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[11];而APS可抑制NLRP3炎性小體的激活,降低炎性介質(zhì)IL-1β和IL-18的生成,在過敏性鼻炎、血管炎中減少炎癥的發(fā)生[12,13]。因此,本研究以流感病毒肺炎大鼠模型為對(duì)象,從NLRP3炎癥小體方面探究APS在流感病毒性肺炎治療中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6-8周齡SPF級(jí)Wistar大鼠40只,雌雄各半,體質(zhì)量180-220 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證為SCXK(京)2019-0009。將所有大鼠放在可控制的光照下保持12 h明暗交替,溫度22-24 ℃,相對(duì)濕度為45%-60%,可以自由獲取食物和水。研究已由機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn),并遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》。

1.2 病毒和細(xì)胞

甲型流感病毒A/FM1/47(H1N1)(中國疾病預(yù)防控制中心),將該病毒在Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司,CL-0154)中進(jìn)行噬菌斑純化,并在9日齡的雞胚中復(fù)制。兩次常規(guī)雞胚復(fù)蘇后,血凝滴度為1 ∶40。通過雙重稀釋法測定了不同濃度的病毒感染后14 d大鼠的死亡率。使用引起20%大鼠死亡的病毒濃度(血凝滴度1 ∶640)進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。

1.3 試劑及儀器

黃芪多糖(純度70%,上海吉至生化科技有限公司,貨號(hào):C54200);大鼠白介素1β(IL-1β)(R0012c)、白介素18(IL-18)(R0567c)ELISA檢測試劑盒購買于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;HE染色試劑、RIPA裂解液和BCA試劑盒(碧云天生物科技公司,批號(hào)分別為C0105、P0013B、P0012S);TRIzol RNA分離試劑及SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒均購買于日本TaKaRa公司;PCR引物由上海Gene Pharma合成;兔抗NLRP3(ab263899)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)、山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)(ab205719)均購自英國abcam公司;小鼠抗大鼠cleaved Caspase-1 P10(sc-56036)、cleaved Caspase-1 P20(sc-398715)均購自美國Santa Cruz公司。

1.4 方法

1.4.1 分組、造模及干預(yù) 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始實(shí)驗(yàn)。將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、模型組(model)、黃芪多糖低劑量組(APS-L組,50 mg/kg)、黃芪多糖高劑量組(APS-H組,100 mg/kg)[12],每組10只。1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,將大鼠腹部朝上放置,除對(duì)照組外,其余大鼠使用注射器將100 μl的流感病毒A/FM1/47懸浮液(血凝滴度1 ∶640)[3]交替滴入兩側(cè)鼻孔,建立病毒性肺炎模型,對(duì)照組滴入等量無菌生理鹽水。APS各劑量組在感染24 h后,灌胃給予相應(yīng)劑量的黃芪多糖,對(duì)照組和模型組灌胃等量生理鹽水,1次/d,持續(xù)5 d。觀察大鼠一般狀態(tài)。

1.4.2 計(jì)算肺指數(shù)檢測肺水腫程度 肺指數(shù)用于反映肺水腫的嚴(yán)重程度。在測量體重后,將大鼠的肺取出,預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后,濾紙吸干多余水分,然后稱量,計(jì)算大鼠肺指數(shù)。肺指數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肺勻漿中炎性因子水平 將大鼠左肺分為兩部分,放入凍存管中,液氮速凍后,-80 ℃冰箱保存用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot實(shí)驗(yàn);右肺分為兩部分,一部分固定于4%多聚甲醛中,另一部分右肺組織稱重后按照1 ∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水制備10%的組織勻漿,研磨后離心取上清液,ELISA檢測勻漿中IL-1β、IL-18含量。

1.4.4 蘇木精-伊紅染色(HE)觀察肺組織病理學(xué)變化 取4%多聚甲醛中固定的肺組織,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色。在顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.4.5 qRT-PCR檢測肺組織NLRP3 mRNA、IL-1β mRNA水平 取-80 ℃冰箱保存的部分左肺,稱重研磨后用Trizol法提取總RNA,測定每個(gè)樣本RNA濃度后,使用cDNA合成試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μl):cDNA(200 ng/μl)2 μl,SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μl,上下游引物各0.4 μl,ddH2O 7.2 μl。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt(ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值),以β-actin為對(duì)照,進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.6 Western blot檢測肺組織NLRP3、cleaved Caspase-1蛋白表達(dá) 取剩余部分肺組織,按照試劑盒說明書的操作提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,取等量蛋白質(zhì)樣品(30 μg/孔)上樣,SDS-PAGE凝膠電泳,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂奶粉封閉,加入一抗(NLRP3、cleaved Caspase-1 P10、cleaved Caspase-1 P20,按1 ∶1 000的比例稀釋;β-actin,1 ∶2 000稀釋),4 ℃下孵育過夜,HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,ECL顯色,以β-actin為內(nèi)參,通過與內(nèi)參的灰度比,得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)

對(duì)照組大鼠較活躍,毛色光滑,飲食正常,無打噴嚏、咳嗽等癥狀;模型組大鼠活動(dòng)減少、精神倦怠,毛色暗淡無光澤,呼吸淺快、氣喘、食欲不振;APS-L、APS-H組大鼠一般狀態(tài)較模型組明顯減輕,精神狀態(tài)、打噴嚏、氣喘癥狀明顯改善,活動(dòng)和飲食增加。

2.2 各組大鼠肺指數(shù)

與對(duì)照組相比,模型組大鼠肺指數(shù)顯著增加(P<0.05);與模型組相比,APS-L、APS-H組大鼠肺指數(shù)明顯降低(P<0.05);與APS-L組相比,APS-H組肺指數(shù)明顯降低(P<0.05,見表2)。

表2 各組大鼠肺指數(shù)變化比較

2.3 各組大鼠肺組織病理變化

HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)肺組織學(xué)異常變化;模型組大鼠肺組織出現(xiàn)明顯病變,肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡間隔增厚,炎性細(xì)胞浸潤,間質(zhì)充血、水腫;與模型組相比,APS-L、APS-H組肺部的病理損傷明顯改善,且APS-H組肺部的病理損傷改善程度優(yōu)于APS-L組(見圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色 (HE,×200)Figure 1 HE staining of lung tissue of rats in each group (HE,×200)

2.4 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-18含量

與對(duì)照組相比,模型組大鼠肺組織IL-1β、IL-18含量顯著升高(P<0.05);與模型組相比,APS-L組和APS-H組大鼠肺組織IL-1β、IL-18含量明顯降低(P<0.05);與APS-L組相比,APS-H組大鼠肺組織IL-1β、IL-18含量明顯降低(P<0.05,見表3)。

表3 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-18含量

2.5 各組大鼠肺組織NLRP3 mRNA、IL-1β mRNA水平

與對(duì)照組相比,模型組大鼠肺組織NLRP3 mRNA、IL-1β mRNA水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,APS-L組和APS-H組大鼠肺組織NLRP3mRNA、IL-1β mRNA水平明顯降低(P<0.05);與APS-L組相比,APS-H組大鼠肺組織NLRP3 mRNA、IL-1β mRNA水平明顯降低(P<0.05,見表4)。

表4 各組大鼠肺組織NLRP3 mRNA、IL-1β mRNA水平

2.6 各組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比,模型組大鼠肺組織NLRP3、cleaved Caspase-1 P10、cleaved Caspase-1 P20蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,APS-L組和APS-H組大鼠肺組織NLRP3、cleaved Caspase-1 P10、cleaved Caspase-1 P20表達(dá)明顯降低(P<0.05);與APS-L組相比,APS-H組大鼠肺組織NLRP3、cleaved Caspase-1 P10、cleaved Caspase-1 P20表達(dá)明顯降低(P<0.05,見圖2、表5)。

圖2 各組大鼠肺組織NLRP3、cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)Figure 2 expression of NLRP3 and cleaved Caspase-1 proteins in lung tissue of rats in each group

表5 各組大鼠肺組織NLRP3、cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)

3 討論

流感病毒可以感染上、下呼吸道引起嚴(yán)重肺炎合并急性呼吸窘迫綜合征,甚至導(dǎo)致死亡[14]。IAV感染會(huì)導(dǎo)致組織損傷或觸發(fā)抗病毒細(xì)胞因子產(chǎn)生失衡,也稱為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”或“高細(xì)胞因子血癥”,這與IAV引起的嚴(yán)重肺炎聯(lián)系密切[15]。

黃芪是中藥中最重要的補(bǔ)氣調(diào)理中藥之一,可增強(qiáng)人體的免疫力,具有悠久的藥用歷史。最近研究發(fā)現(xiàn)黃芪在各種肺炎中具有重要治療作用,如在抗新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)中黃芪是中藥復(fù)方中常用的高頻單味藥[16,17];APS是從中藥黃芪中提取的主要活性成分,已被廣泛用作免疫增強(qiáng)劑和抗氧化劑[18]。最近,一些研究表明APS可以抑制病毒的復(fù)制,包括季節(jié)性A型流感(H3N2)[19]、禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)[20]、柯薩奇病毒B3(CVB3)[21]等,具有開發(fā)和用作抗病毒藥物的潛力。盧春化等[7,8]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能通過TLR4/7-MyD88-NF-κB信號(hào)通路緩解流感病毒誘導(dǎo)的小鼠肺炎性損傷,具有抗流感病毒感染的作用。本研究評(píng)估了APS對(duì)IAV感染大鼠的影響,結(jié)果表明APS可降低促炎性因子IL-18、IL-1β水平,緩解流感病毒感染引起的肺部炎癥和臨床癥狀,減輕大鼠肺部病變;說明APS可有效保護(hù)IAV感染大鼠免受進(jìn)一步損害。

NLRP3炎性小體是由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)與前半胱天冬酶1(pro-caspase-1)形成的多蛋白復(fù)合物。其中,NLRP3蛋白是NLRP3炎性小體活性核心,它在許多細(xì)胞中都有表達(dá)類型,包括先天免疫[22]、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[23]、肺上皮細(xì)胞[24]等。NLRP3炎性小體過度活化在冠狀病毒SARS-COV-2引起多器官衰竭的發(fā)病機(jī)制中起主導(dǎo)作用,SARS-COV-2可以直接激活NLRP3,而NLRP3炎性小體被激活后,pro-caspase-1會(huì)進(jìn)行自激活和裂解,以產(chǎn)生具有活性的cleaved Caspase-1(P10、P20),進(jìn)而將pro-IL-1β和pro-IL-18分別裂解為成熟的IL-1β和IL-18,以及介導(dǎo)幾種生物活性的損傷相關(guān)分子模式分子(DAMP)的釋放,引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”[25]。因此,NLRP3蛋白表達(dá)和IL-1β水平常被用于監(jiān)測NLRP3炎性小體的活化。研究發(fā)現(xiàn),甲型H1N1流感病毒引起的重癥肺炎中NLRP3炎性小體被顯著活化,而抑制NLRP3炎性小體的活化,可降低下游炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18水平,可以減輕嚴(yán)重流感性肺炎引起的肺部病理損害[11]。何佳等[4]發(fā)現(xiàn)APS可下調(diào)ASC、cleaved Caspase-1的表達(dá),抑制NLRP3炎性小體的活化;Xu等[12]也發(fā)現(xiàn)APS可通過抑制NLRP3炎性小體的激活,降低炎癥細(xì)胞因子水平,減輕過敏性鼻炎大鼠的鼻部癥狀和病理變化;以上研究均提示APS可抑制NLRP3炎性小體的活化。本研究通過qRT-PCR和Western blot檢測了IAV感染后,大鼠肺組織中NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá),結(jié)果均顯示,IAV感染后大鼠肺組織中NLRP3被激活,同時(shí)IL-1β mRNA水平和cleaved Caspase-1表達(dá)增加;而APS處理后,NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),且IL-1β、IL-18水平及cleaved Caspase-1(P10、P20)蛋白表達(dá)明顯降低;說明APS在流感病毒感染后,可明顯抑制NLRP3炎癥小體的活化。

綜上所述,APS可能通過抑制NLRP3炎癥小體的活化,進(jìn)而降低IL-1β、IL-18水平,減輕流感病毒感染引起的肺部炎性損傷。但本研究尚存在一定不足,NLRP3炎癥小體是通過什么途徑被激活,以及黃芪多糖能否通過其他通路保護(hù)流感病毒性肺炎,仍需進(jìn)一步研究。