丁建才,胡博然*,林嵐,范雪梅,范永峰

1(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州,225127) 2(貴州茅臺(tái)酒廠昌黎葡萄酒業(yè)有限公司,河北 昌黎,066611)

葡萄酒釀造是多種微生物參與代謝的過程[1],其中細(xì)菌、酵母菌、霉菌等微生物在其生產(chǎn)及風(fēng)味形成過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[2]。不同微生物之間共生和代謝的相互作用形成了一個(gè)復(fù)雜的微生物群落,并在一定程度上影響葡萄酒的香氣[3-4]和風(fēng)味。而釀酒原料、釀造工藝、地理位置及氣候條件等因素會(huì)影響釀酒微生物群落結(jié)構(gòu)[5]。

近年來,由于高通量測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序時(shí)間短、測(cè)序通量高的優(yōu)勢(shì),國(guó)內(nèi)外研究者將該技術(shù)應(yīng)用于對(duì)釀酒微生物進(jìn)行分類鑒定、監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中釀酒微生物群落動(dòng)態(tài)變化、追溯酒類風(fēng)味物質(zhì)以及辨別酒類產(chǎn)品是否摻假等方面。在葡萄酒領(lǐng)域,高通量測(cè)序用于對(duì)葡萄表面的微生物多樣性進(jìn)行研究,發(fā)酵過程中微生物的多樣性及動(dòng)態(tài)變化也有相關(guān)報(bào)道。PORTILLO等[6]使用高通量測(cè)序分析,研究了歌海娜和卡里尼亞葡萄漿果上的細(xì)菌多樣性,表明不同品種葡萄漿果上的微生物具有差異。ZHANG等[7]利用16S rRNA和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)測(cè)序?qū)ζ咸压ど衔⑸锏慕M成進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)葡萄品種在塑造細(xì)菌和真菌群落方面起著重要作用,幾種重要的細(xì)菌和真菌類群的豐富性有所區(qū)別。SETATI等[8]選取整個(gè)ITS對(duì)南非3個(gè)相鄰葡萄園的赤霞珠葡萄漿果真菌群落進(jìn)行測(cè)序,得出相鄰葡萄園之間真菌群落的構(gòu)成存在極顯著差異。

大多數(shù)研究集中在不同品種釀酒葡萄果皮的細(xì)菌、真菌群落的構(gòu)成,對(duì)不同品種、不同發(fā)酵階段真菌群落的組成與差異研究較少,且針對(duì)昌黎產(chǎn)區(qū)不同葡萄品種發(fā)酵過程中真菌群落的研究未見報(bào)道。本研究采用ITS—ITS2區(qū)高通量測(cè)序方法,分析昌黎產(chǎn)區(qū)不同釀酒葡萄品種在自然發(fā)酵過程中真菌群落的差異與變化;評(píng)估真菌群落的組成和豐度,為日后深入研究河北昌黎產(chǎn)區(qū)葡萄酒中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其在發(fā)酵中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用釀酒葡萄來自昌黎縣茅臺(tái)葡萄園,茅臺(tái)葡萄園位于鳳凰山腳下,基地建于2012年。隨機(jī)采摘成熟期時(shí)的蛇龍珠、赤霞珠、馬瑟蘭3個(gè)葡萄品種,用手套從植物上手工收獲并保存在無菌袋,放在冰盒中運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室。新鮮葡萄果實(shí)破碎壓榨后進(jìn)行自然發(fā)酵。每天使用密度計(jì)對(duì)所有發(fā)酵過程進(jìn)行監(jiān)測(cè),并在3個(gè)不同的發(fā)酵階段采集50 mL樣品:發(fā)酵初期(第 2 天)、發(fā)酵中期(第 4 天)、發(fā)酵末期(第 6 天)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因DNA的提取

按照DNA提取試劑盒:MOBIO PowerSoil?DNA Isolation Kit的步驟進(jìn)行。完成基因組DNA抽提后,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

PCR擴(kuò)增體系:DNA模板30 ng,正反向引物(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAA-3′和3′-TGCGTTC-TTCATCGATGC-5′,5 μmol/L)各1 μL,3 μL 2 ng/μL 牛血清白蛋白溶液,12.5 μL 2×TaqPlus Master Mix,7.5 μL ddH2O。擴(kuò)增程序如下:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,28個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min,每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的條帶大小,并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化。后續(xù)文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序委托北京奧維森生物科技股份有限公司南京分公司進(jìn)行,測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq PE300。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控及操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)基礎(chǔ)分析

MiSeq測(cè)序得到的是Pair-End(PE)雙端序列數(shù)據(jù),利用Trimmomatic、Pear對(duì)測(cè)得的Fastq數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控處理,得到Fasta序列;再利用Flash、Pear根據(jù)PE的overlap關(guān)系對(duì)兩端序列進(jìn)行拼接(merge)處理,最終得到raw-tags;根據(jù)已知數(shù)據(jù)庫(kù)用UCHIME方法比對(duì)去除Fasta序列的嵌合體,對(duì)于未知數(shù)據(jù)庫(kù)使用自比對(duì)(denovo)方法進(jìn)行去除,同時(shí)去除不合要求的短序列,得到優(yōu)質(zhì)序列clean-tags。

根據(jù)不同的相似度水平,對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分,對(duì)97%相似水平的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。將clean-tags用聚類方式生成OTUs[9]。采用RDP Classifier算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行比對(duì)分析,并在門、屬、種水平注釋其群落的物種信息,得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息。利用MAFFT進(jìn)行序列對(duì)齊,FastTree進(jìn)行建樹,根據(jù)Python語言把物種(屬)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行可視化展示。利用R語言進(jìn)行主成分統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豐富性和多樣性分析

稀釋性曲線[10]可說明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí),更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU,反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。因此,通過作稀釋性曲線,可得出樣品的測(cè)序深度情況。圖1為相似度在97%條件下不同品種釀酒葡萄發(fā)酵前、中、后期真菌ITS1—ITS2區(qū)的稀釋曲線,當(dāng)真菌OTU數(shù)量達(dá)到70個(gè)左右時(shí),曲線開始趨于平緩,說明本研究中樣品的取樣深度足夠,測(cè)序數(shù)量足以覆蓋所有類群。

CGE1-蛇龍珠發(fā)酵前期；CGM2-蛇龍珠發(fā)酵中期；CGL3-蛇龍珠發(fā)酵后期；-赤霞珠發(fā)酵前期； CSM2-赤霞珠發(fā)酵中期；CSL3-赤霞珠發(fā)酵后期；ME1-馬瑟蘭發(fā)酵前期；MM2-馬瑟蘭發(fā)酵中期；ML3-馬瑟蘭發(fā)酵后期(下同)圖1 不同樣品稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of different samples

Chao1反映菌種豐富度,豐富度即樣本中的物種數(shù),樣本中物種越多,樣本越豐富。物種豐富度不考慮每個(gè)物種的相對(duì)豐度,它給于相對(duì)豐度低的物種與相對(duì)豐度高物種相同的權(quán)重。如表1所示,不同品種釀酒葡萄發(fā)酵前、中、后期真菌的豐富度指數(shù)Chao1最大的為發(fā)酵中期的馬瑟蘭,Chao1指數(shù)最小的為發(fā)酵前期的蛇龍珠,說明這9個(gè)樣品中發(fā)酵中期的馬瑟蘭物種最豐富,發(fā)酵前期的蛇龍珠最少。

表1 不同樣品真菌群落的豐富度和多樣性指數(shù)Fig.1 Fungi community richness and diversity index of different samples

均勻度反映不同物種的相對(duì)豐度。多樣性隨物種豐富度和均勻度的增加而增加。多樣性指數(shù) Shannon 和Simpson,是反映樣品中物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。Shannon 和Simpson值越高說明群落物種的多樣性越高。由表1可知,同一發(fā)酵階段不同品種中,赤霞珠的真菌群落多樣性最高,其次是馬瑟蘭,蛇龍珠最低。同一品種不同發(fā)酵階中,均為發(fā)酵前期真菌群落多樣性最高,其次是中期,發(fā)酵后期真菌群落多樣性最低。

2.2 葡萄酒釀造生境真菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

基于ITS1—ITS2區(qū)對(duì)真菌種類的區(qū)分度,利用MAFFT和FastTree法,以屬為單位選取對(duì)應(yīng)豐度最大的OTU的代表序列進(jìn)行建樹。由圖2可知,干紅葡萄酒釀造生境中主要有114個(gè)屬,分屬7個(gè)門,分別是子囊菌門、擔(dān)子菌門、球囊菌門、壺菌門、梳霉門、油壺菌門和被孢霉門,其中83個(gè)為子囊菌門,24個(gè)為擔(dān)子菌門,2個(gè)為球囊菌門,2個(gè)為壺菌門,1個(gè)為梳霉門,1個(gè)為油壺菌門,1個(gè)為被孢霉門。這表明干紅葡萄酒釀造生境中的真菌多樣性非常豐富,干紅葡萄酒的釀造是多種微生物共同作用的結(jié)果,子囊菌門為優(yōu)勢(shì)門。

圖2 昌黎產(chǎn)區(qū)葡萄酒釀造生境真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of fungi in the winemaking habitat of Changli region

2.3 真菌種類和豐度分析

可視化對(duì)比多個(gè)樣本的群落結(jié)構(gòu),可以觀測(cè)其變化情況[11]。如圖3-a所示,在門水平,9個(gè)樣品發(fā)酵前中后期真菌群落均以子囊菌門為主,蛇龍珠、赤霞珠、馬瑟蘭發(fā)酵前期子囊菌門的相對(duì)豐度分別為92.35%、93.67%、92.92%,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,相對(duì)豐度增加,到蛇龍珠、赤霞珠、馬瑟蘭發(fā)酵后期,分別為98.85%、99.06%、99.36%;其次是未被鑒定的菌門;再次是擔(dān)子菌門,蛇龍珠、赤霞珠、馬瑟蘭發(fā)酵前期擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度分別為0.28%、0.28%、0.69%,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,豐度逐漸下降,到后期時(shí),分別只有0.22%、0.25%、0.11%。

如圖3-b所示,在屬水平,9個(gè)樣品的真菌分布在7個(gè)屬,分別為漢遜酵母屬、釀酒酵母屬、未被鑒定的屬、短梗霉屬、青霉屬、被孢霉屬、炭疽菌屬。發(fā)酵前期的蛇龍珠、赤霞珠、馬瑟蘭樣品中漢遜酵母屬的相對(duì)豐度最大,分別為84.72%、80.26%、81.50%;其次是釀酒酵母屬,分別為10.23%、4.97%、3.43%。發(fā)酵中期的蛇龍珠、赤霞珠、馬瑟蘭樣品中釀酒酵母屬的相對(duì)豐度最大,分別為90.40%、63.84%、62.92%;其次是漢遜酵母屬,分別為2.62%、33.70%、33.87%。發(fā)酵后期的蛇龍珠、赤霞珠、馬瑟蘭樣品中釀酒酵母屬的相對(duì)豐度最大,分別為96.18%、92.40%、90.62%,其次為漢遜酵母屬,分別為1.22%、3.55%、7.87%。由第4天釀酒酵母的相對(duì)豐度可知,蛇龍珠的發(fā)酵速度較赤霞珠和馬瑟蘭快,在第4天時(shí)釀酒酵母已占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

a-門水平;b-屬水門圖3 在門和屬水平上,不同釀酒葡萄品種發(fā)酵前、中、后期真菌群落的差異Fig.3 Fungal communities early,middle and late fermentation of different wine grape varieties at phylum and genus levels

整體而言,釀酒酵母屬在發(fā)酵初期開始存在,在發(fā)酵中期數(shù)量迅速增加,在發(fā)酵中后期占絕對(duì)優(yōu)勢(shì);而漢遜酵母屬在發(fā)酵初期大量存在,占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),隨著發(fā)酵的進(jìn)行,中期相對(duì)豐度迅速減少,到后期時(shí)更低。由此可見,在昌黎產(chǎn)區(qū)蛇龍珠、赤霞珠、馬瑟蘭葡萄酒發(fā)酵過程中,早期漢遜酵母屬最先發(fā)展起來,中后期逐漸讓位于釀酒酵母。

2.4 不同釀酒葡萄品種發(fā)酵前、中、后期真菌OTUs分析

花瓣圖是一種表示樣本或組間特有和共有OTU數(shù)目的展示方式。每個(gè)花瓣代表一個(gè)樣品,中間的core數(shù)字代表的是所有樣品共有的OTU數(shù)目,花瓣上的數(shù)字代表該樣品特有的OTU數(shù)目。由圖4可知,蛇龍珠、赤霞珠、馬瑟蘭發(fā)酵前、中、后期9個(gè)樣品中共有的OTU數(shù)為32。蛇龍珠發(fā)酵前中后期的OTU個(gè)數(shù)分別為133、159、177,赤霞珠發(fā)酵前中后期的OTU個(gè)數(shù)分別為79、132、141,馬瑟蘭發(fā)酵前中后期的OTU個(gè)數(shù)分別為135、186、109。由此可見,同一產(chǎn)區(qū)不同品種釀酒葡萄在發(fā)酵過程中菌群既有相同又存在差異。

圖4 蛇龍珠、赤霞珠、馬瑟蘭發(fā)酵不同時(shí)期真菌群落的OTU分布花瓣圖Fig.4 OTU petal distribution of fungal communities in different stages of fermentation in Cabernet Gernischt, Cabernet Sauvignon and Marselan

將32個(gè)共有OTU進(jìn)行豐度分析，得出豐度前20的OTU(表2)分別是：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)、耐滲透壓有孢漢遜酵母(Hanseniasporaosmophila)、葡萄園有孢漢遜酵母(Hanseniasporavineae)、Pseudaleuriasp.、出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、長(zhǎng)被孢霉(Mortierellaelongata)、球狀小孢葡萄穗霉(Stachybotrysmicrospora)和普魯藍(lán)久浩酵母(Guehomycespullulans)等。

S.cerevisiae是傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌株,具有較高的乙醇和其他抑制物耐受性[12-13]。S.cerevisiae作為發(fā)酵中后期的主導(dǎo)菌種,通過自身代謝活動(dòng)和非香型前體物質(zhì)的釋放等方式促進(jìn)醇類、酯類、萜類、揮發(fā)性硫醇等揮發(fā)性香氣物質(zhì)的產(chǎn)生[14]。H.uvarum是葡萄園和葡萄酒釀造環(huán)境中常見的含量最豐富的非釀酒酵母[15]。H.uvarum促進(jìn)去甲類異戊二烯類和一些萜烯類糖苷的水解,增加葡萄酒的溫帶水果和花香特征[16]。H.osmophila可發(fā)酵產(chǎn)生乙酸酯類化合物[17]。ZHANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)H.vineae和S.cerevisiae混合發(fā)酵對(duì)2-苯基乙酸乙酯的產(chǎn)生具有協(xié)同作用,2-苯基乙酸乙酯具桃子香氣。

A.pullulans是一類類酵母真菌,存在于葡萄汁和發(fā)酵前期。研究發(fā)現(xiàn)其能提高葡萄酒中的總花色苷含量、總多酚指數(shù)[19]。M.alpina是一種具有很強(qiáng)脂質(zhì)合成能力的產(chǎn)油絲狀真菌。M.elongata、M.alpina等菌種均含有γ-亞油酸、EPA、DHA。S.microspora是一種絲狀真菌,該菌在葡萄酒中具有一定的水解纖維素、促進(jìn)紅葡萄汁浸提等的作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)G.pullulans在低溫(8 ℃)下仍能產(chǎn)果膠酶[21]。果膠酶具有提高葡萄出汁率、澄清果汁、提高果皮中花色素苷等多重效果[22-24]。寧亞麗等[25]發(fā)現(xiàn)G.pullulans是朝鮮族傳統(tǒng)米酒酒曲中的優(yōu)勢(shì)菌。雖然這幾種菌相對(duì)豐度很低,但它們協(xié)同的作用,在提高葡萄酒質(zhì)量和香氣塑造等方面同樣發(fā)揮作用。

表2 不同樣品共有OTUTable 2 Common OTU of different samples

2.5 不同釀酒葡萄發(fā)酵過程中真菌群落相似性分析

如圖5所示,主成分1和主成分2分別解釋了不同品種樣品發(fā)酵前中后期真菌群落88.94%和5.52%的信息,兩主成分之和大于90%,則表明2個(gè)成分較好地代表了樣品中的真菌群落信息。9份樣品之間有一定距離,說明9份樣品的真菌群落有一定差異;相比之下,蛇龍珠的3個(gè)樣品距離較近,差異不大,說明不同發(fā)酵時(shí)期的蛇龍珠樣品真菌群落相似性高;不同發(fā)酵時(shí)期的赤霞珠樣品間距離較大,差異顯著,說明發(fā)酵前中后期的赤霞珠樣品間真菌群落有很大差異;不同發(fā)酵時(shí)期的馬瑟蘭樣品間距離較大,差異顯著,說明發(fā)酵前中后期的馬瑟蘭樣品間真菌群落有很大差異。整體來說,不同發(fā)酵時(shí)期蛇龍珠樣品間真菌群落相似性高,赤霞珠和馬瑟蘭樣品間真菌群落差異性高。

圖5 不同樣品真菌群落主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis of fungal communities in different samples

3 結(jié)論

通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)昌黎產(chǎn)區(qū)3種釀酒葡萄品種發(fā)酵過程中真菌群落進(jìn)行分析,得出發(fā)酵前期葡萄醪中主要優(yōu)勢(shì)菌為漢遜酵母屬,發(fā)酵中后期優(yōu)勢(shì)菌為釀酒酵母;不同品種不同發(fā)酵階段樣品中均有釀酒酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、耐滲透壓有孢漢遜酵母、葡萄園有孢漢遜酵母、出芽短梗霉、高山被孢霉、長(zhǎng)被孢霉、球狀小孢葡萄穗霉、普魯藍(lán)久浩酵母等;相對(duì)于漢遜酵母屬和釀酒酵母,其他幾種菌的相對(duì)豐度很小,分別僅占0.001%～1.300%左右;除蛇龍珠樣品外,同一品種不同發(fā)酵階段真菌組成差異顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為深入研究河北昌黎地區(qū)葡萄酒中微生物群落結(jié)構(gòu)及其對(duì)葡萄酒風(fēng)格塑造方面的影響提供了理論基礎(chǔ)。