高欣偉,崔樹茂,唐鑫,毛丙永,趙建新,陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

長(zhǎng)雙歧桿菌(Bidifobacteriumlongum)廣泛分布于人體腸道中,具有改善腸道微生物群、調(diào)節(jié)腸道通透性、提高腸道免疫力、緩解腸道易激綜合征和抵抗腸道炎癥等益生作用[1-4]。提高長(zhǎng)雙歧桿菌的生產(chǎn)效率,拓展其應(yīng)用是益生菌行業(yè)亟需解決的問題之一[5]。但是,由于生物合成缺陷及嚴(yán)格厭氧等特性,長(zhǎng)雙歧桿菌的培養(yǎng)密度較低,制約了其工業(yè)化生產(chǎn)的升級(jí)[6]。

優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)工藝是提高長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)密度的主要手段。目前,有關(guān)碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響研究相對(duì)成熟,葡萄糖以其低廉的價(jià)格和高效的增殖效率,常被用作雙歧桿菌的首選碳源;乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽等緩沖鹽已被證實(shí)在分批培養(yǎng)時(shí)主要通過減緩pH的降低從而提高生物量,在恒pH培養(yǎng)時(shí)不會(huì)促進(jìn)菌體的生長(zhǎng),在此條件下培養(yǎng)雙歧桿菌可不添加緩沖鹽[7]。而氮源的選擇尚無得出規(guī)律性結(jié)論,雙歧桿菌因其種屬、生境等的差異,對(duì)氮源的利用并無顯著的偏好性;雙歧桿菌的主要微量元素雖然已明確是鎂和錳,但是在高密度培養(yǎng)時(shí)隨著生物量的大幅提高,菌體濃度與微量元素濃度之間的關(guān)系尚不明確。因此在長(zhǎng)雙歧桿菌的培養(yǎng)基優(yōu)化中還需解決氮源和微量元素的問題。

前期研究已經(jīng)證實(shí),雙歧桿菌在恒pH分批培養(yǎng)過程中,酸根積累引起的滲透壓升高是其生長(zhǎng)的主要抑制因素[8],這也解釋了為什么初始培養(yǎng)基底物濃度過高會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)。但是菌株生長(zhǎng)的最高生物量又與底物濃度呈正相關(guān)[9],底物濃度低,達(dá)不到最優(yōu)的培養(yǎng)效果;底物濃度高,又會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)。如何控制底物濃度是雙歧桿菌恒pH分批培養(yǎng)亟需解決的難題。此外,底物的碳氮比在很大程度上會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)代謝[7],基于什么原則設(shè)定碳氮比亦是需要重點(diǎn)解決的問題。

本研究通過解析長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)氮源利用的偏好性與限制性微量元素,優(yōu)化培養(yǎng)基組分;并進(jìn)一步探索最高生物量與滲透壓、底物濃度三者之間的關(guān)系,優(yōu)化培養(yǎng)工藝,以期確定長(zhǎng)雙歧桿菌高密度培養(yǎng)策略。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株

長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)CCFM 687、長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 1029、長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7,來源于江南大學(xué)食品生物中心菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨(CT)、牛肉浸膏(BEF)、酵母浸膏粉(YEF)、D(+)-無水葡萄糖、無水乙酸鈉、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、檸檬酸氫二鈉、K2HPO4、Na2HPO4、吐溫80、L-半胱氨酸鹽酸鹽、NaOH、NaCl、瓊脂粉,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;牛肉膏(BE),北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;牛肉蛋白胨(BEP),上海士鋒生物科技有限公司;葡萄糖測(cè)定試劑盒,上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;酵母蛋白胨FP103(FP103)、酵母浸粉FM803(FM803)、酵母浸粉FM528(FM528)、酵母提取物FD00-A(YE)、大豆蛋白胨FP410(SP)、安琪蛋白胨FP351(FP351)、安琪蛋白胨FP326(FP326),安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī),Eppendorf公司;l?ser-om806 m型冰點(diǎn)滲透壓測(cè)定儀,德國(guó)l?ser公司;BIOTECH—3000發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備工程有限公司;AW500SG 厭氧工作站;分光光度計(jì),賽默飛世爾科技公司;FE20型pH計(jì)、EL3002型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MS 3 basic型渦旋振蕩器,德國(guó)IKA公司;MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋,日本SANYO公司;ZHJH-C1115B型超凈工作臺(tái),上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;UV-2450紫外分光光度計(jì),日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將3株長(zhǎng)雙歧桿菌接種于MRS固體培養(yǎng)基中,倒置于厭氧工作站中37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接液體管繼續(xù)厭氧培養(yǎng)24 h。重復(fù)上述操作2次可得到活化后的種子液。

1.3.2 氮源利用的偏好性分析

按照氮源快速篩選培養(yǎng)基:1 g/L氮源、6 g/L葡萄糖、7 g/L K2HPO4、7 g/L Na2HPO4、0.25 g/L MgSO4·7H2O、0.05 g/L MnSO4·H2O、1 g/L半胱氨酸鹽酸鹽配制培養(yǎng)基,調(diào)pH 6.4,115 ℃滅菌20 min。其中氮源分別為:酵母類氮源、胰蛋白胨、牛肉類氮源、魚蛋白胨、大豆蛋白胨;對(duì)照組采用0.2 g/L酵母提取物、0.4 g/L牛肉膏和0.4 g/L魚蛋白胨作為氮源。培養(yǎng)基于超凈工作臺(tái)以5%接入種子液,置于厭氧工作站37 ℃培養(yǎng),測(cè)定18、20 h的OD600值。

1.3.3 生長(zhǎng)限制性微量元素(Mg和Mn)分析

采用限制性微量元素篩選培養(yǎng)基:1 g/L最佳氮源、6 g/L葡萄糖、7 g/L K2HPO4、7 g/L Na2HPO4、半胱氨酸1 g/L配制成4組不同微量元素比例的培養(yǎng)基(A組:無Mg、Mn;B組:0.087 g/L MgSO4·7H2O;C組:0.060 g/L MnSO4·H2O;D組:0.043 g/L MgSO4·7H2O,0.030 g/L MnSO4·H2O),調(diào)pH 6.4,115 ℃滅菌20 min。將種子液用PBS洗滌2次后,以5%的接種量接入以上4組培養(yǎng)基中,于厭氧工作站中37 ℃發(fā)酵,取18、20 h發(fā)酵液測(cè)定OD600值。

1.3.4 不同滲透壓條件下生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

用NaCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓,配制不同滲透壓梯度(350～1 350 mOsm/kg)的MRS培養(yǎng)基。取不同滲透壓梯度的培養(yǎng)基添加至24孔板,設(shè)置3個(gè)平行。將活化好的種子液以5%的接種量接種于24孔板中,置于厭氧工作站中37 ℃恒溫培養(yǎng)20 h,每隔2 h振勻后測(cè)定OD600值。以發(fā)酵時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),懸濁液的OD600值為縱坐標(biāo),繪制長(zhǎng)雙歧桿菌在不同滲透壓條件下的生長(zhǎng)曲線。

相比較于初始OD600,培養(yǎng)20 h無顯著增長(zhǎng)的滲透壓即為完全抑制滲透壓。

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi),長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)規(guī)律如公式(1)所示:

(1)

式中:A0,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)長(zhǎng)雙歧桿菌的初始數(shù)量;At,t時(shí)刻長(zhǎng)雙歧桿菌的數(shù)量;G,長(zhǎng)雙歧桿菌的代時(shí)。由公式(1)可知,在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi),log2At與時(shí)間t成線性,且代時(shí)為斜率的倒數(shù)。

根據(jù)不同滲透壓條件下的生長(zhǎng)曲線判斷長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間,分別以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間為自變量,對(duì)應(yīng)的OD600為應(yīng)變量,基于SPSS一元線性回歸分析求得長(zhǎng)雙歧桿菌在不同滲透壓下的代時(shí)。采用多重比較對(duì)不同滲透壓下的代時(shí)進(jìn)行差異分析,與350 mOsm/kg對(duì)應(yīng)的代時(shí)相比有顯著增長(zhǎng)的滲透壓即為生長(zhǎng)速率被抑制滲透壓。

1.3.5 碳氮消耗比的測(cè)定

選用最適氮源按方法1.3.2方法配制優(yōu)化培養(yǎng)基,發(fā)酵過程中每隔2 h測(cè)定樣本中懸濁液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度和葡萄糖含量,測(cè)定生長(zhǎng)曲線。根據(jù)生長(zhǎng)曲線分別測(cè)定菌株在生長(zhǎng)速率被抑制和生長(zhǎng)完全被抑制時(shí)的碳氮消耗比。

1.3.6 最適生長(zhǎng)pH的測(cè)定

根據(jù)初始抑制滲透壓和碳氮消耗比確定培養(yǎng)基的初始碳氮濃度(吐溫80 1 mL/L,MgSO4·7H2O 0.25 g/L,MnSO4·H2O 0.05 g/L,半胱氨酸1 g/L),取3.5 L發(fā)酵液添加至平行發(fā)酵罐,滅菌后氮?dú)獗?.1 MPa。按5%的接種量接菌,在37 ℃恒溫下,分別在pH為5.00、5.75、6.50的發(fā)酵液中恒pH發(fā)酵。每隔2 h測(cè)定OD600,在生長(zhǎng)穩(wěn)定期計(jì)數(shù)發(fā)酵液中的活菌數(shù)。

1.3.7 生長(zhǎng)限制性微量元素的最適添加量

參照方法1.3.6的培養(yǎng)基配方,其中微量元素按照最佳比例,總量由0.70、1.05、1.40 mmol/L配制成發(fā)酵液,依次取3.5 L發(fā)酵液添加至平行發(fā)酵罐,滅菌后通入氮?dú)獠⒈?.1 MPa。接入5%的種子液,于最適生長(zhǎng)pH、37 ℃發(fā)酵。對(duì)數(shù)期開始每隔2 h取樣測(cè)定OD600,取穩(wěn)定期發(fā)酵液計(jì)數(shù)。

1.3.8 測(cè)定方法

將待測(cè)液以對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基作為空白,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600 nm下菌懸液的OD600值;采用葡萄糖試劑盒測(cè)定葡萄糖含量;采用標(biāo)準(zhǔn)平皿法對(duì)樣品中的總菌落進(jìn)行計(jì)數(shù);使用冰點(diǎn)滲透壓儀測(cè)滲透壓。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)中每個(gè)實(shí)驗(yàn)值均是3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。不同組間的差異顯著性采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行ANOVA分析(DUNCAN檢驗(yàn)),P<0.05則認(rèn)為差異顯著;采用Graphpad 8.01進(jìn)行生長(zhǎng)曲線和柱形圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 限制性底物的分析和優(yōu)化

2.1.1 氮源利用的偏好性

本研究首先比較長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)不同單一氮源的利用率。長(zhǎng)雙歧桿菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)易受到酸性和碳源不足的抑制,導(dǎo)致進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)培養(yǎng)基中仍存在很多氮源未被利用,因此傳統(tǒng)培養(yǎng)基無法衡量長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)氮源的利用率。因此,采用方法1.3.2,在傳統(tǒng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,減碳氮添加量,同時(shí)增加碳氮比,且通過增加無機(jī)鹽濃度使長(zhǎng)雙歧桿菌在氮源耗盡前解除pH和碳源不足的抑制。圖1顯示了不同氮源(1 g/L)對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生物量的影響。

a-長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687;b-長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 1029;c-長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7(下同) YE-酵母提取物;FP103-酵母蛋白胨FP103;FM803-酵母浸粉FM803;FM528-酵母浸粉FM528;YEF-酵母浸膏粉;CT-胰蛋白胨;SP-大豆蛋白胨;FP351-安琪蛋白胨FP351;BE-牛肉膏;FP326-安琪蛋白胨FP326;BEF-牛肉浸膏;BEP-牛肉蛋白胨;MRS-MRS氮源篩選培養(yǎng)基(下同)圖1 長(zhǎng)雙歧桿菌氮源篩選Fig.1 The cells concentration of B.longum growing with different nitrogen source注:不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

長(zhǎng)雙歧桿菌普遍對(duì)酵母提取物、酵母蛋白胨FP103、酵母浸粉FM803、酵母浸粉FM528利用率較高,其次是大豆蛋白胨、安琪蛋白胨FP351(魚)、安琪蛋白胨FP326(牛骨)。長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687、長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 1029、長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7最佳氮源分別是安琪蛋白胨FM103、酵母提取物、酵母浸粉FM803,由此可知長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)酵母類氮源利用率最高。LIU等[10]研究表明,乳酸菌對(duì)酵母提取物利用程度高是因?yàn)榻湍柑崛∥锔缓衔?、維生素、嘌呤堿和嘧啶堿;在酵母提取物中發(fā)現(xiàn)的維生素中,煙酸、泛酸、核黃素、葉酸和吡哆醇是刺激乳酸菌生長(zhǎng)所必需的B族維生素[11]。此外,有研究表明兩歧雙歧桿菌對(duì)酵母類氮源的利用率較低,推測(cè)影響雙歧桿菌對(duì)氮源利用程度的因素,除了氮源是否富含生長(zhǎng)因子,還有菌株對(duì)氮源種類的偏好性。

朱丹鳳等[12]采用液相色譜分析,發(fā)現(xiàn)安琪蛋白胨FP351(魚)和大豆蛋白胨可利用肽分子量區(qū)間比酵母提取物高,但長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)魚蛋白胨或大豆蛋白胨作為單一氮源的利用效果卻顯著低于酵母提取物,猜測(cè)它們單獨(dú)作為氮源時(shí)未被充分利用;為進(jìn)一步探究氮源中的生長(zhǎng)因子是否為影響增殖濃度差異的主要因素,將富含生長(zhǎng)因子的酵母浸粉與其他氮源1∶1復(fù)配,比較長(zhǎng)雙歧桿菌在復(fù)合氮源生長(zhǎng)的活菌濃度是否大于單一氮源的疊加。

表1 氮源復(fù)配對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響(OD600)Table 1 Effect of nitrogen source combination on the growth of B.longum(OD600)

經(jīng)計(jì)算比較,長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687和CCFM 1029對(duì)復(fù)配氮源的利用率與理論值相比無顯著差異,即復(fù)配不能提高長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687和CCFM 1029對(duì)魚、大豆蛋白胨及牛肉浸膏的利用率。長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7對(duì)魚蛋白胨和牛肉浸膏的復(fù)配氮源利用率顯著高于理論的疊加值,表明長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7可利用魚蛋白胨與牛肉浸膏,但作為單一氮源時(shí),因缺少生長(zhǎng)因子而利用率較低;而酵母類氮源與大豆蛋白胨在復(fù)配后,實(shí)際生長(zhǎng)值未顯著高于理論值,說明大豆蛋白胨作為單一氮源時(shí)已被充分利用,或者未能利用的部分是不可利用氮源。因此長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)氮源的利用程度取決于氮源是否富含生長(zhǎng)因子和自身對(duì)氮源的偏好性。

綜上,長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)酵母類氮源利用性最佳,魚蛋白胨和牛肉類氮源次之,胰蛋白胨和大豆蛋白胨最差;酵母浸粉FM803能夠促進(jìn)長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7對(duì)魚蛋白胨和牛肉浸膏的利用,但復(fù)配后的增殖效果與單一的酵母類氮源無顯著差異;酵母浸粉對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687和CCFM 1029利用其他氮源無促進(jìn)效果。因此選用安琪酵母浸粉FM803作為最佳氮源進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.2 生長(zhǎng)限制性微量元素分析

在培養(yǎng)基中添加礦物質(zhì)和其他微量元素起到酶激活劑的作用,對(duì)微生物的繁殖至關(guān)重要。Mn2+是多數(shù)乳桿菌生長(zhǎng)和繁殖所必需的[13-15],不同于乳桿菌,長(zhǎng)雙歧桿菌有其獨(dú)特的雙歧代謝途徑[16]。其中,果糖-6-磷酸酮糖酶作為雙歧桿菌特有的酶,被認(rèn)為是雙歧桿菌的科的分類學(xué)標(biāo)記,需要Mg2+、Ca2+或Mn2+等作為輔助因子與活性位點(diǎn)結(jié)合使酶正常工作。其中,果糖-6-磷酸酮糖酶與Mg2+結(jié)合具有更高的轉(zhuǎn)化效率。

根據(jù)圖2可知,對(duì)比A組和C組,長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687、長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7和長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 1029的單獨(dú)添加MnSO4組相對(duì)于空白組對(duì)細(xì)胞濃度無顯著性提升,所以Mn不是長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)限制性微量元素;對(duì)比B組、C組和D組,發(fā)現(xiàn)低濃度且Mg、Mn總物質(zhì)的量一定時(shí),長(zhǎng)雙歧桿菌的細(xì)胞濃度隨Mg2+濃度增加而顯著增長(zhǎng),單獨(dú)添加MgSO4時(shí)最高。因此長(zhǎng)雙歧桿菌的限制性微量元素是Mg。

A-無Mg、Mn;B-Mg;C-Mn;D-m(Mg)∶m(Mn)=1∶1圖2 不同微量元素比例對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)影響Fig.2 Effect of different trace element ratio on B.longum growth

圖3 雙歧桿菌葡萄糖代謝途徑示意圖Fig.3 Schematic representation of glucose degradation through “bifid shunt” in Bifidobacteria

雙歧桿菌葡萄糖代謝途徑及關(guān)鍵酶如圖3[17-18],通過查詢Universal Protein數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)可得關(guān)鍵酶的輔助因子(表2)。由表2可知,乙酸激酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的輔助因子可以是Mg2+或Mn2+[19],兩者可相互替代;葡糖激酶和半乳糖激酶則需要ATP與Mg2+絡(luò)合為MgATP2+的形式作為輔助因子參與反應(yīng)[19-20];磷酸甘油酸激酶只能以Mg2+作為輔助因子;Mg2+不是5-磷酸核糖異構(gòu)酶的輔助因子[21],但長(zhǎng)雙歧桿菌在實(shí)際發(fā)酵過程中單獨(dú)添加Mg2+活菌量最高,歸因于酵母含有豐富的Co2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+[22],而過量的Mn2+會(huì)抑制長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)。

表2 雙歧桿菌葡萄糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶及其輔助因子Table 2 The key enzymes and cofactors in the glucose metabolism pathway of Bifidobacteria

2.1.3 最適生長(zhǎng)滲透壓和完全抑制滲透壓

中性條件下,雙歧桿菌代謝產(chǎn)生的醋酸和乳酸對(duì)細(xì)胞無顯著毒害作用,對(duì)其生長(zhǎng)的抑制歸因于滲透壓升高[16]。因此可通過分析雙歧桿菌在不同滲透壓下的生長(zhǎng)曲線,獲得初始抑制滲透壓和完全抑制滲透壓,進(jìn)而估算出初始添加多少的碳氮源總量經(jīng)過雙歧代謝途徑,在發(fā)酵終點(diǎn)可達(dá)到完全抑制滲透壓。

由圖4可知,長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687和CCFM 1029初始抑制滲透壓都為750 mOsm/kg,長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY17L7初始抑制滲透壓為550 mOsm/kg;長(zhǎng)雙歧桿菌687在滲透壓為1 250 mOsm/kg時(shí)被完全抑制生長(zhǎng);長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 1029在滲透壓為1 050 mOsm/kg時(shí)被完全抑制,長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7在滲透壓為850 mOSM/kg時(shí)被完全抑制。

2.2 長(zhǎng)雙歧桿菌培養(yǎng)工藝優(yōu)化

2.2.1 最適碳氮比

在進(jìn)行恒pH培養(yǎng)時(shí),碳源或氮源不足,都會(huì)抑制長(zhǎng)雙歧桿菌增殖。為了進(jìn)一步探究補(bǔ)料和初始培養(yǎng)基中的碳氮源最適添加比例,根據(jù)方法1.3.7計(jì)算長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)速率被抑制和生長(zhǎng)被完全抑制時(shí)的碳氮消耗比。王玉林等[7]發(fā)現(xiàn),按生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的碳氮消耗比配制培養(yǎng)基,菌株增值效率最高。

由圖5可知,長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687碳氮消耗比為(3.02±0.38),長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 1029為(2.78±0.25),長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7為(3.04±0.34)。考慮到實(shí)驗(yàn)誤差和菌株之間的代謝差異,為保證長(zhǎng)雙歧桿菌在生長(zhǎng)過程提供充足的氮源,本實(shí)驗(yàn)按碳氮消耗比為2.50進(jìn)行培養(yǎng)基配制和補(bǔ)料。

a、b-長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687;c、d-長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 1029;e、f-長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7圖4 長(zhǎng)雙歧桿菌在不同滲透壓條件下的生長(zhǎng)曲線及代時(shí)Fig.4 Growth curve and generation time of B.longum under different osmotic pressure

圖5 長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的消耗碳氮比Fig.5 The consumption ratio of carbon and nitrogen when the growth rate of B.longums is suppressed

2.2.2 最適生長(zhǎng)pH

雙歧桿菌生長(zhǎng)過程中會(huì)不斷積累醋酸和乳酸,低pH乳酸以未解離形式存在,易轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部,對(duì)菌體具有強(qiáng)烈抑制作用[16];通過調(diào)節(jié)pH可控制乳酸菌產(chǎn)生最大生物量或最多代謝產(chǎn)物。因此,探索雙歧桿菌最適pH,進(jìn)行恒pH培養(yǎng)對(duì)提高雙歧桿菌的最高活菌數(shù)具有重要意義。根據(jù)1.3.5對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行不同pH培養(yǎng),表3顯示了長(zhǎng)雙歧桿菌在不同恒pH培養(yǎng)的最高活菌數(shù)以及每組對(duì)比另外兩組差異的顯著性。長(zhǎng)雙歧桿菌在恒pH 5.00的條件下發(fā)酵所得的最高活菌數(shù)最高,與恒pH 5.75和恒pH 6.50條件發(fā)酵的最高活菌數(shù)有極顯著差異,說明恒pH 5.00是長(zhǎng)雙歧桿菌的最適發(fā)酵pH。

表3 長(zhǎng)雙歧桿菌不同恒pH培養(yǎng)的最高活菌數(shù)(×108) 單位： CFU/mL

2.3 恒pH分批培養(yǎng)

2.3.1 碳氮濃度的優(yōu)化

根據(jù)范氏滲透壓公式,培養(yǎng)基的滲透壓和溶質(zhì)的濃度可根據(jù)公式(2)關(guān)聯(lián):

π=icRT

(2)

式中:π,滲透壓;i,無量綱范氏常數(shù);c,溶液濃度;R,摩爾氣體常數(shù);T,熱力學(xué)溫度。在一定培養(yǎng)條件下,溫度為37 ℃,氮?dú)獗?.1 MPa,則摩爾氣體常數(shù)和熱力學(xué)溫度一定;忽略溶液中分子和離子間相互作用力,則滲透壓與溶液中能產(chǎn)生滲透效應(yīng)的分子和離子總濃度(即滲透物質(zhì)濃度)成正比。

雙歧桿菌在發(fā)酵前后培養(yǎng)基所含氮源的各分子量肽總量幾乎不變[12],因此氮源發(fā)酵前后提供的滲透壓不變。假設(shè)在恒pH分批培養(yǎng)過程中醋酸與乳酸經(jīng)NaOH溶液中和,pH恒定為5.00。電解質(zhì)乙酸在水溶液中達(dá)到電離平衡時(shí):

CH3COOH=CH3COO-+H+,

則有公式(3):

(3)

式中:c[CH3COO-]、c[H+]、c[CH3COOH]分別表示CH3COO-、H+、CH3COOH在電離平衡時(shí)的濃度,Ka1，乙酸的離子平衡常數(shù)。為確定37 ℃、pH 5.0時(shí),c[CH3COO-]和c[CH3COOH]的比值,將公式(3)調(diào)整為公式(4):

(4)

經(jīng)調(diào)研可知,醋酸常溫下電離平衡常數(shù)為1.810-5,pH為5.0時(shí)H+濃度約為10-5mol/L,將其代入公式(4)得到式(5):

(5)

CH3COO-來源于CH3COOH或者CH3COONa的電離,因此根據(jù)式(1)的分析,1分子CH3COO-提供兩倍于CH3COOH的滲透壓;結(jié)合公式(5)可以推導(dǎo)算出1分子乙酸經(jīng)NaOH中和,再水解電離后滲透壓約變?yōu)樵瓉淼?.65倍。

同理,參考公式(2)和公式(4),可得公式(6):

(6)

式中:c[CH3CH(OH)COO-]、c[CH3CH(OH)COOH]、c[H+]分別表示CH3CH(OH)COO-、CH3CH(OH)COOH、H+在離子平衡時(shí)物質(zhì)的量濃度,Ka2表示乳酸的離子平衡常數(shù)。將乙酸常溫下電離平衡常數(shù)1.3810-4代入公式(6)可得:

(7)

類似的可以推算出1分子乳酸經(jīng)NaOH中和,再水解電離后滲透壓約變?yōu)樵瓉淼?.93倍。綜上,理論上1分子葡萄糖經(jīng)雙歧代謝產(chǎn)生1分子乳酸和1.5分子醋酸,在NaOH調(diào)節(jié)pH 5.00時(shí),葡萄糖經(jīng)雙歧桿菌代謝產(chǎn)酸滲透壓變?yōu)樵瓉淼?.4倍;根據(jù)高于90%以上的葡萄糖被轉(zhuǎn)換為有機(jī)酸以及完全抑制滲透壓,可計(jì)算出初始需添加的碳氮源總量。

參照上述推導(dǎo)結(jié)果,得出所需添加的碳氮含量(表4)?；谇懊孢x取的最優(yōu)氮源、限制性微量元素Mg的添加量以及最適pH,根據(jù)1.3.7比較添加理論所需碳氮和過量碳氮發(fā)酵至穩(wěn)定期,最高活菌數(shù)是否存在差異。

表4 長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)至完全抑制滲透壓理論所需碳氮添加量Table 4 Amount of glucose and nitrogen needed by B.longum to reach theoretical maximum osmotic pressure

2.3.1.1 長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687的碳氮濃度優(yōu)化

為驗(yàn)證上述推導(dǎo)得出的理論碳氮需求量能夠滿足長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定期,且長(zhǎng)雙歧桿菌最高活菌數(shù)能夠到達(dá)最高值。以表4的理論所需碳氮量配制培養(yǎng)基為A組;以初始培養(yǎng)基滲透壓為500 mOsm/kg,按照碳氮消耗比添加過量底物,配制的培養(yǎng)基設(shè)為B組。

A組:按照葡萄糖50 g/L、酵母浸粉FM803 20 g/L配制成3.5 L培養(yǎng)基不補(bǔ)料;B組:按照葡萄糖60 g/L、酵母浸粉FM803 24 g/L配制成3.5 L培養(yǎng)基,不補(bǔ)料。穩(wěn)定期收菌時(shí),測(cè)得A組培養(yǎng)基中仍剩余2.17 g/L葡萄糖,滲透壓穩(wěn)定在1 094 mOsm/kg,說明長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687的理論碳氮源添加量(表4)與實(shí)際需求量一致。根據(jù)圖6可知,A組和B組則無顯著性差異,但在實(shí)際收菌過程中發(fā)現(xiàn)A組在20 h達(dá)到穩(wěn)定期,相比B組的發(fā)酵周期(22 h)更短,可能是初始滲透壓較高導(dǎo)致延滯期較長(zhǎng)所致。綜上所述,選擇使用A組培養(yǎng)方式發(fā)酵長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687具備更顯著的優(yōu)勢(shì)。

圖6 長(zhǎng)雙歧桿菌不同培養(yǎng)工藝的最高活菌數(shù)Fig.6 Cells concentration of B.longum fermented in different culture processes

2.3.1.2 長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 1029的碳氮濃度優(yōu)化

A組:按照葡萄糖42.5 g/L、酵母浸粉FM803 17 g/L配制成3.5 L培養(yǎng)基不補(bǔ)料;B組同上。在穩(wěn)定期測(cè)得A組葡萄糖含量為3.58 g/L,滲透壓為1 032 mOsm/kg,與理論推導(dǎo)結(jié)果相接近。根據(jù)圖6可知,2個(gè)組最高活菌數(shù)沒有顯著性差異;測(cè)得A組穩(wěn)定期剩余葡萄糖含量為0.34 g/L,A組穩(wěn)定期滲透壓為1 032 mOsm/kg,B組穩(wěn)定期滲透壓為1 053 mOsm/kg,與理論完全抑制滲透壓接近,說明長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7根據(jù)公式推導(dǎo)出表4的理論碳氮源添加量與實(shí)際需求量一致。在實(shí)際培養(yǎng)過程中B組培養(yǎng)至穩(wěn)定期時(shí)間長(zhǎng)于A組2 h,因此實(shí)際生產(chǎn)過程中選擇A組作為長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 1029的發(fā)酵工藝。

2.3.1.3 長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7的碳氮濃度優(yōu)化

A組:按照葡萄糖33 g/L、酵母浸粉FM803 14 g/L配制成3.5 L培養(yǎng)基不補(bǔ)料;B組同上。測(cè)得A組穩(wěn)定期葡萄糖含量為0.26 g/L,滲透壓為688 mOsm/kg,遠(yuǎn)低于理論完全抑制滲透壓。在收菌時(shí)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7不能離心到菌泥,可能是由于該菌種在發(fā)酵過程中消耗了部分葡萄糖而產(chǎn)生了較多的莢膜多糖。結(jié)合公式(1)所推導(dǎo)的結(jié)論可知:多分子葡萄糖結(jié)合成為莢膜多糖,則溶液中能產(chǎn)生滲透效應(yīng)的分子總物質(zhì)的量濃度變低,導(dǎo)致實(shí)際滲透壓值與理論值偏差較大。根據(jù)圖6可知,長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7在A組和B組的最高活菌數(shù)無顯著性差異,但A組的發(fā)酵工藝更經(jīng)濟(jì)。

綜上可知,根據(jù)長(zhǎng)雙歧桿菌的完全抑制滲透壓計(jì)算所需碳氮源總量,將全部碳氮源加入培養(yǎng)基進(jìn)行恒pH不補(bǔ)料分批培養(yǎng)是最佳發(fā)酵工藝。

2.3.2 最適微量元素濃度的優(yōu)化

根據(jù)2.1.2可知,Mg2+作為長(zhǎng)雙歧桿菌的限制性微量元素,添加量不足會(huì)直接影響雙歧桿菌的最高活菌數(shù)。通過計(jì)算得出常規(guī)MRS培養(yǎng)基中所含的微量元素濃度為0.70 mmol/L,因此分別以含0.70、1.05和1.40 mmol/L(即0.17、0.26和0.35 g/L) MgSO4的MRS進(jìn)行三聯(lián)罐恒pH分批發(fā)酵試驗(yàn)。由圖7可知,厭氧發(fā)酵18～22 h后,長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687和CCFM 1029在C組中的最高活菌數(shù)相比于A組均顯著增長(zhǎng);而長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7雖然C組的最高活菌數(shù)最多,但三組間無顯著性差異,據(jù)此推測(cè)長(zhǎng)雙歧桿菌所能達(dá)到的最高活菌數(shù)決定了不同株對(duì)微量元素需求的差異。所以培養(yǎng)基中MgSO4的最適添加量確定為0.35 g/L(即1.40 mmol/L)。

A組-MgSO4濃度0.70 mmol/L;B組-MgSO4濃度1.05 mmol/L;C組-MgSO4濃度1.40 mmol/L圖7 微量元素添加量對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌最高活菌數(shù)的影響Fig.7 Effects of trace element dosages on the highest viable count of B.longum

3 結(jié)論

(1)長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)酵母類氮源利用效率較高,安琪(魚)蛋白胨FP351、胰蛋白胨和牛肉類氮源次之;大豆蛋白胨最差。長(zhǎng)雙歧桿菌的限制性微量元素是Mg,在一定范圍內(nèi)菌濃與其添加量呈正相關(guān)。

(2)長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687、長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 1029與長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7生長(zhǎng)速率被抑制滲透壓分別是750、750和550 mOsm/kg,完全抑制滲透壓分別是1 250、1 050和850 mOsm/kg。

(3)以酵母浸粉FM803作為氮源、葡萄糖作為碳源時(shí),培養(yǎng)長(zhǎng)雙歧桿菌的最適碳氮比為菌株生長(zhǎng)過程中生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的碳氮消耗比。根據(jù)理論推導(dǎo)1分子葡萄糖經(jīng)雙歧途徑產(chǎn)酸被NaOH溶液中和后,發(fā)酵液中滲透壓提高到初始值的4.4倍,基于發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液滲透壓為完全抑制滲透壓推算得到的底物濃度最有利于長(zhǎng)雙歧桿菌的高效增殖。

(4)長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 687添加50.0 g/L葡萄糖、20.0 g/L酵母浸粉FM803、0.35 g/L MgSO4·7H2O,恒pH 5.00培養(yǎng)18 h的最高活菌數(shù)達(dá)(7.9±1.1)×109CFU/mL;長(zhǎng)雙歧桿菌CCFM 1029添加42.5 g/L葡萄糖、17.0 g/L酵母浸粉FM803、0.35 g/L MgSO4·7H2O,恒pH 5.00培養(yǎng)18 h的最高活菌數(shù)達(dá)(9.3±0.5)×109CFU/mL;長(zhǎng)雙歧桿菌FGSZY 17L7添加33.0 g/L葡萄糖、13.5 g/L酵母浸粉FM803、0.35 g/L MgSO4·7H2O,恒pH 5.00培養(yǎng)18 h的最高活菌數(shù)達(dá)(1.1±0.1)×1010CFU/mL,是MRS恒pH分批培養(yǎng)的40～80倍。