李俊娥,毛亞玲,祝霞,韓舜愈,楊學山*

1(甘肅農業(yè)大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室,甘肅 蘭州 730070)

酒酒球菌(Oenococcusoeni)作為啟動MLF的優(yōu)良菌種,可將來源于葡萄果實的L-蘋果酸轉化為圓潤的L-乳酸,改善口感、增加微生物穩(wěn)定性[1-2],并通過自身代謝釋放揮發(fā)性香氣物質,修飾葡萄酒的風味,提高感官品質[3]。雖然MLF在適宜條件下可自發(fā)啟動,但過程緩慢且結果難以預測,往往不能得到令人滿意的結果[4-5],而人工接種優(yōu)良的酒酒球菌快速啟動MLF不僅可以提高酒質,而且可以縮短發(fā)酵周期,降低生產成本。

在實際生產中,為防止商業(yè)菌株大量使用而導致的葡萄酒同質化問題,篩選產區(qū)O.oeni菌種是增強葡萄酒地域特征的有效方法。張春暉[6]對我國葡萄酒主產區(qū)的蘋果酸-乳酸菌進行分離和鑒定,獲得了發(fā)酵性能優(yōu)良的O.oeni菌株。薛雪[7]從寧夏銀川葡萄酒樣中分離出1株具有良好降酸能力和產香能力的O.oeni菌株。在釀造過程中,由于酵母與乳酸菌可能存在協(xié)同、拮抗等相互作用,因此傳統(tǒng)的MLF接種方式主要以酒精發(fā)酵(alcohol fermentation,AF)結束后的順序接種為主[8]。有學者認為,與順序接種相比,同時接種O.oeni菌株混合發(fā)酵過程中對酒精濃度的逐漸適應,以及葡萄汁中更高的有效性營養(yǎng),可使MLF更容易成功[9-10]。KNOLL等[8]在研究中沒有觀察到同時發(fā)酵對葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的負面影響,且發(fā)酵酒樣中乙酯和乙酸酯濃度更高。同時接種在節(jié)約了更多的發(fā)酵時間的同時降低了腐敗微生物生長的風險[11-12]。趙現華等[13]通過不同的MLF接種方式釀造蛇龍珠葡萄酒,發(fā)現順序接種發(fā)酵的葡萄酒中揮發(fā)性物質總量較高。TRISTEZZA等[14]發(fā)現同時接種在減少發(fā)酵時間的同時可降低揮發(fā)酸,且葡萄酒體顯示出與酯相關的紅色水果味以及與琥珀酸二乙酯和乳酸乙酯相關的黃油和奶油味。李憑等[15]在AF不同時間接入植物乳桿菌與酵母混合發(fā)酵,證實AF第1天接入植物乳桿菌的發(fā)酵方式在加快了發(fā)酵速率的同時,其酒樣酸度、高級醇含量降低,酯類含量有明顯的提高。

甘肅河西走廊作為我國葡萄酒特色產區(qū)之一,具有生產高品質葡萄酒的天然優(yōu)勢。本研究以赤霞珠釀酒葡萄為原料,以釀酒酵母純種發(fā)酵為對照,采用甘肅河西走廊葡萄酒產區(qū)本土O.oeni菌株GF-2、ZX-1,及商業(yè)菌VP41,按照不同接種方式進行MLF,分析其對干紅葡萄酒的主要揮發(fā)性香氣物質的影響,以期為生產具有產區(qū)微生物特色的葡萄酒提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

葡萄酒酵母:Aroma White酵母(Saccharomycescerevisiae),購于意大利Enartis公司。

釀酒葡萄赤霞珠:2019年9月24日采摘自甘肅農業(yè)大學葡萄園(北緯36°5′25″、東經103°41′32″),總糖為208.00 g/L,可滴定酸(以酒石酸計)6.088 g/L,成熟度良好。

酒酒球菌菌株:本土O.oeniGF-2、ZX-1菌株均分離自河西走廊葡萄酒產區(qū),由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室鑒定并保存。

商業(yè)乳酸菌:乳酸菌(LALVIN VP41),原產法國,購自上?？奠称凤嫎I(yè)有限公司。

ATB培養(yǎng)基[16]:葡萄糖10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,瓊脂20 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,MnSO4·4H2O 0.05 g/L,半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L,番茄汁25%(體積分數),使用1 mol/L NaOH調pH值至4.8,121 ℃滅菌20 min。

試劑:L-蘋果酸檢測試劑盒,愛爾蘭Megazyme公司;2-辛醇(內標物),乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸甲酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸、金合歡醇、香葉醇、β-香茅醇、(Z)-橙花叔醇、α-萜品醇、β-大馬士酮、里那醇、苯乙醇、戊醇、己醇等香氣標準品均為色譜純,美國Sigma公司;葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、偏重亞硫酸鈉、果膠酶、MgSO4、MnSO4、NaOH、無水乙醇等均為分析純,購自天津光復化工研究所。

1.2 儀器與設備

生化培養(yǎng)箱(LRH),上海一恒科學儀器有限公司;超凈工作臺(SW-CJ-2FD),蘇州安泰空氣技術有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS),上海申安醫(yī)療器械廠;紫外可見分光光度計(UV-6100),上海元析儀器有限公司;氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(TRACE 1310-ISQ)、單四級桿質譜儀(ISQ),美國Thermo Scientific公司;色譜柱(DB-WAX),美國Agilent Technologies公司;固相微萃取裝置、萃取頭(50/30 μm DVB/CAR-PDMS),美國Surpelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

釀酒酵母菌株活化:將釀酒酵母(Aroma White酵母)菌株干粉溶于10倍體積的dd H2O中,在28 ℃恒溫水浴活化10 min;再加入等體積的赤霞珠葡萄汁,23 ℃恒溫水浴活化10 min。

酒酒球菌菌株活化與培養(yǎng):按要求配制ATB液體培養(yǎng)基,于121 ℃濕熱條件滅菌20 min后,在超凈工作臺中靜置冷卻。取斜面冷凍保存的O.oeni菌株,室溫下2 h后,挑取2環(huán)接種于ATB液體培養(yǎng)基中,于28 ℃生化培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)。

商品菌株VP41按照產品使用說明(0.01 g/L)進行活化。將VP41活性干粉溶于10倍體積的dd H2O中,28 ℃恒溫水浴活化10 min;再加入等體積赤霞珠葡萄汁,23 ℃恒溫水浴活化10 min。

1.3.2 接種方式

本試驗采取同時接種(接種釀酒酵母24 h后接種酒酒球菌)和順序接種(AF發(fā)酵結束后)2種方式,分別接入本土酒酒球菌GF-2、ZX-1和商品菌VP41,同時設置空白對照CK。同時接種酒樣編號:T-GF、T-ZX、T-VP41;順序接種酒樣編號:S-GF、S-ZX、S-VP41。每個處理重復3次。

1.3.3 葡萄酒釀造試驗

1.3.3.1 工藝流程[17]

工藝要點:赤霞珠釀酒葡萄采收后人工篩選、除梗破碎,裝入5.0 L發(fā)酵容器中,裝液量為4.0 L,添加60 g/L SO2、20 mg/L果膠酶,紗布封口,室溫靜置12 h,然后根據1.3.2分別按釀酒酵母0.2 g/L、商業(yè)菌VP41 0.01 g/L、本土O.oeni5%接種啟動AF和MLF,MLF結束[ρ(L-蘋果酸)<0.2 g/L]后取樣待測。

1.3.4 葡萄酒理化指標測定

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》分析測定葡萄酒中pH值、殘?zhí)恰⒖偹?、揮發(fā)酸、酒精度等基本理化指標[18]。L-蘋果酸測定參照試劑盒說明進行操作,測定發(fā)酵酒樣中L-蘋果酸含量。

1.3.5 葡萄酒中揮發(fā)性香氣成分提取檢測

參考祝霞等[19]的方法,使用HS-SPME和GC-MS技術對不同試驗處理的酒樣的香氣物質進行檢測。

香氣成分富集:取8 mL待測酒樣于15 mL頂空瓶中,加入2.5 g NaCl和10 μL內標物(質量濃度81.06 mg/L),加磁力攪拌轉子后密封并搖勻,置于恒溫磁力攪拌器中,40 ℃水浴平衡30 min后頂空萃取30 min。GC-MS分析條件:DB-WAX毛細管色譜柱(60 m×2.5 mm×0.25 μm);進樣口溫度240 ℃,進樣5 min,不分流進樣;柱溫升溫程序:初溫50 ℃保持5 min,再以3.0 ℃/min升溫至200 ℃,保持15 min;載氣高純氦氣(He)流速1 mL/min;MS條件:電子轟擊離子源;電子能量70 eV;質譜掃描范圍m/z20～350。

1.3.6 揮發(fā)性香氣成分的定性與定量分析

定性與定量:參考祝霞等[19]的方法,采用保留指數(retention index,RI)和NIST-11、Wiley及香精香料譜庫檢索比對,結合譜圖分析進行定性,確定香氣物質。對已有的標準品的酯類、高級醇、萜烯類等化合物,利用其標準曲線(R2>0.995)進行定量,無標準品的香氣化合物采用化學結構、官能團相似、碳原子數相近的標準物質進行半定量。

1.4 葡萄酒感官評價

參照VARELA等[20]的方法,略作修改。所有酒樣進行隨機編號,并由10名具有一定葡萄酒品嘗經驗或經過專業(yè)培訓的人員(男女各5人)對酒樣進行感官評定。分別從外觀(澄清度、顏色強度),香氣(花香、果香、甜味、脂肪味)和風味(酸度、濃郁度、余味長短、平衡感)共10個方面對酒樣進行評價,使用10分結構化數值進行量化,0～10分表示感官逐漸增強。

1.5 數據統(tǒng)計與處理

根據葡萄酒釀造試驗所得數據采用Microsoft Office Excel 2019、Origin 2018以及SPSS 20.0軟件進行基本統(tǒng)計分析與數據處理。

2 結果與分析

2.1 主要理化指標分析

表1為2種不同接種方式發(fā)酵得到的赤霞珠干紅葡萄酒的基本理化指標。由表1可知,各理化指標均符合GB/T 15037—2006的要求。T-GF、T-ZX、T-VP41、S-GF、S-ZX、S-VP41等6個處理組的殘?zhí)?、L-蘋果酸、總酸含量顯著低于對照組CK(P<0.05),pH值和揮發(fā)酸含量均高于對照組CK,說明MLF在降低L-蘋果酸、柔化酒體酸度的同時還消耗了部分還原糖,減少了二次發(fā)酵風險。就接種方式來看,同時接種的處理組總酸、揮發(fā)酸、色度、色調均顯著高于順序接種組(P<0.05)。同時接種(即AF、MLF同時進行)耗時10 d,順序接種(AF結束后接種乳酸菌啟動MLF)耗時21 d。

表1 赤霞珠干紅葡萄酒基本理化指標分析Table 1 Analysis of basic physical and chemical indexes of Cabernet Sauvignon dry red wine

2.2 揮發(fā)性香氣物質分析

本試驗利用GC-MS對不同試驗處理酒樣的揮發(fā)性物質進行檢測(詳細數據見增強出版附件表1[21-25]),不同接種方式釀造的赤霞珠干紅葡萄酒中揮發(fā)性化合物的種類及含量見圖1。綜合分析,不同接種方式、菌株發(fā)酵的酒樣產生的同類化合物種類和含量均存在差異。本試驗7組不同處理的酒樣共檢測出81種揮發(fā)性化合物,其中酯類30種,醇類27種,酸類7種,萜烯類8種以及9種其他類化合物。7個處理組揮發(fā)性化合物種類及含量分別為T-GF(56種,23 044.75 μg/L)、T-ZX(68種,18 048.56 μg/L)、T-VP41(72種,20 804.74 μg/L)、S-GF(59種,20 278.77 μg/L)、S-ZX(62種,19 715.60 μg/L)、S-VP41(69種,19 253.31 μg/L)、CK(59種,11 609.68 μg/L)。

a-酯類化合物;b-醇類化合物;c-酸類化合物;d-萜烯類化合物;e-其他類物質圖1 葡萄酒揮發(fā)成分的GC-MS分析Fig.1 Volatile components of wine samples by GC-MS analysis

2.2.1 酯類化合物

酯類化合物大多呈現水果香氣。如乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、壬酸乙酯、辛酸乙酯以及癸酸乙酯等,具有蘋果、草莓、香蕉和桃李等水果香[26-27]。本實驗7個不同處理組共檢測出30種酯類化合物。由增強出版附表1可知,未進行MLF的空白對照組酯類化合物含量及種類(CK:2 832.59 μg/L,22種)明顯低于其他MLF處理組(P<0.05)。同時接種的3個處理組酯類化合物含量顯著高于順序接種處理組(P<0.05),尤其是乙酯類化合物,極大地豐富了酒體的果香味;同一種接種處理組也存在菌株差異,同時接種處理組的VP41菌株酯類化合物種類、含量均占有明顯優(yōu)勢,本土O.oeniGF-2、ZX-1次之。

2.2.2 醇類化合物

高級醇屬于酵母酒精發(fā)酵過程中糖代謝和氨基酸轉化的次級代謝產物之一[28]。由增強出版附表1可知,醇類化合物在所有揮發(fā)性物質中含量占比最大,本研究中共檢測到27種醇類化合物,7組種類及含量分別為T-GF(19種,14 830.95 μg/L)、T-ZX(23種,12 017.72 μg/L)、T-VP41(25種,13 181.66 μg/L)、S-GF(20種,15 017.22 μg/L)、S-ZX(20種,14 675.77 μg/L)、S-VP41(23種,14 200.29 μg/L)、CK(24種,8 502.18 μg/L),除未進行MLF的空白對照組高級醇含量較低外,其余7組無明顯差異,且與同時接種處理組相比,順序接種組醇類化合物含量較高。同時,苯乙醇(玫瑰香、桃子味)、戊醇(辣味)、正己醇(酒精味、青草香)、異丁醇(水果香、花香)含量占比較大。無論同時還是順序接種處理,本土O.oeniGF-2均比ZX-1具有明顯優(yōu)勢。7組酒樣均含一定量的苯乙醇,使酒體具有獨特的紫羅蘭香、丁香、茴香和玫瑰香味。

2.2.3 酸類化合物

酸類化合物一般來源于葡萄酒發(fā)酵過程中酵母和乳酸菌代謝所得的副產物,其多數化合物具有醋酸、腐臭及不愉快的脂肪酸味,但在較低濃度時可平衡酒體果香,賦予酒體特殊奶酪味[29-30]。由增強出版附表1可知,本試驗共檢測到7種酸類化合物,其中T-GF(4種,395.57 μg/L)、T-ZX(5種,260.79 μg/L)、T-VP41(6種,164.95 μg/L)、S-GF(6種,589.62 μg/L)、S-ZX(7種,389.68 μg/L)、S-VP41(7種,271.69 μg/L)、CK(4種,81.91 μg/L)。對比空白對照處理CK可知,MLF可明顯提高葡萄酒酸類化合物含量。本土O.oeniGF-2、ZX-1產生有機酸含量均高于商業(yè)菌株VP41,且GF-2、ZX-1菌種間也存在較大差異。

2.2.4 萜烯類化合物

萜烯類化合物在葡萄酒香氣成分中具有較大的貢獻,其香氣感官閾值極低,因此少量的萜烯類物質即可賦予葡萄酒較好的花果香和品種香[20,31]。由增強出版附表1可知,本實驗7個處理組酒樣共檢測到8種萜烯類化合物,分別為香茅醇、橙花醇、香葉醇、松油醇、四氫薰衣草醇、大馬士酮、香葉基丙酮和β-紫羅酮,且7個酒樣中萜烯類含量由高到低為T-GF>T-VP41>S-GF>S-VP41>S-ZX>T-ZX>CK。CK組萜烯類化合物含量明顯低于其他6組,所以MLF可以提高葡萄酒萜烯類化合物含量,賦予酒體強烈的花果香,進而豐富葡萄酒整體風味。

2.2.5 其他化合物

由增強出版附表1可知,7個不同處理的釀造酒樣除酯類、醇類、酸類及萜烯類化合物外,還檢測到醛、酮、酚、醚等9種其他化合物,其中苯甲醛(烘烤味、苦杏仁味)、甲基庚烯酮(水果香)賦予葡萄酒特殊的風味。對比空白對照CK組可知,MLF可明顯提高揮發(fā)性化合物種類及含量,同時接種處理較順序接種處理在揮發(fā)性化合物種類及含量上均具有明顯優(yōu)勢。

2.3 揮發(fā)性化合物主成分分析

由于本試驗檢測到的揮發(fā)性化合物種類多、含量差異較大,因此采用主成分分析法確定不同接種方式釀造的赤霞珠干紅葡萄酒的特征成分。對不同接種處理酒樣的81種揮發(fā)性化合物以特征值>1提取主成分,進行主成分分析,并對葡萄酒香氣特征貢獻不大的香氣成分因子舍去,最后剩余19種成分構成整個原始數據的主成分,得到PC1、PC2和PC3的方差貢獻率分別為48.334%、23.085%和13.572%,三個主成分累計方差貢獻率為84.991%,代表原始數據84.991%的信息。各揮發(fā)性化合物在PC1、PC2和PC3上的因子載荷圖及揮發(fā)性化合物主成分分析酒樣分布圖見圖2、圖3。

a-PC1-PC2;b-PC1-PC3圖2 揮發(fā)性化合物主成分分析的因子載荷圖Fig.2 Factor loading plots of PCA for volatile aroma compounds

由圖2可知,月桂酸乙酯(花果香氣)、乙酸苯乙酯(玫瑰花香、蘋果香)苯甲醇(花香、果香)、苯乙醇(蜂蜜香、玫瑰、薔薇香)、正己醇(水果香、花香)、香葉醇(玫瑰花香、檸檬、天竺葵味)、香茅醇(檸檬、柑橘香)等物質在PC1正半軸上的得分較高,即PC1正半軸主要反映了葡萄酒中的花果香特征,而PC1負半軸反映的香氣信息較少;乙酸乙酯(水果香、酯香)、癸酸乙酯(脂肪酸味、水果味)、辛酸乙酯(花果香、杏子香)、辛酸甲酯(柑橘香氣)、乙酸異戊酯(水果香、酸甜味)等物質在PC2正半軸上的得分較高,即PC2正半軸主要反映了果香、脂肪香的香氣特征;而化合物2-甲基丁酸(黃油、乳酪味)、辛酸(奶油味)、戊醇(雜醇油氣味、辣味)等物質在PC3正半軸上的得分較高,即代表葡萄酒的奶酪香特征。

由圖3可知,T-GF、S-GF、S-VP41和T-VP41酒樣位于香氣化合物集聚的區(qū)域,其中T-GF、S-GF及S-VP41處理酒樣分布在PC1正半軸及PC2負半軸,代表了果香、花香、乳酪等奶香味的萜烯類和酸類化合物香氣特征信息。而T-VP41酒樣則處于PC1和PC2正半軸,主要代表了花果香的酯類及醇類化合物香氣特征信息。T-ZX和S-ZX代表了PC1負半軸和PC2正半軸的特征揮發(fā)性化合物信息,主要是乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸甲酯,賦予葡萄酒濃郁的花果香和酯香,增加其香氣復雜性?？瞻滋幚斫MCK處于PC1和PC2的負半軸,該區(qū)域揮發(fā)性化合物較少,且CK處理酒樣與其他6組處理相距較遠,推斷該處理香氣物質較為單一,與其他處理組差異較大。

圖3 揮發(fā)性化合物主成分分析的酒樣分布圖Fig.3 Score plots of wine samples for PCA of the volatile aroma compounds

2.4 赤霞珠干紅葡萄酒感官評價結果分析

由圖4可知,在外觀(色澤、澄清度)方面CK處理組分值較低,與MLF處理組有較為明顯的差異;從香氣(花香、果香、甜味、脂肪味)方面分析,MLF可明顯增強葡萄酒花果香,使其口感變得更加柔和圓潤。同時接種酒樣花香、澄清度、色澤的評分均高于順序接種酒樣,且T-GF處理組酒樣的花果香較為突出,本土O.oeni菌株GF-2、ZX-1的酸度、平衡感、余味長短無明顯差異,但均高于商業(yè)菌株VP41和CK處理組。整體而言,MLF后酒樣在香氣、余味長短、平衡感方面均高于CK組,這是由于MLF提高了酒樣中的酯類、醇類及酸類化合物含量,這與KNOLL等[8]的研究結果一致。綜合分析,利用本土O.oeni進行同時接種MLF后的葡萄酒花果香較為突出,外觀澄清度好,酒體平衡感、濃郁度較強。

圖4 赤霞珠干紅葡萄酒感官分析雷達圖Fig.4 Radar map of sensory analysis for Cabernet Sauvignon dry red wine

3 結論

本研究以赤霞珠釀酒葡萄為原料,選取本土O.oeni菌株GF-2、ZX-1及商業(yè)菌VP41,采用同時和順序2種不同的接種方式啟動MLF釀造赤霞珠干紅葡萄酒。結果表明,MLF過程能降低L-蘋果酸,提高葡萄酒揮發(fā)性物質含量,尤其是酯類和萜烯類;與傳統(tǒng)的順序接種相比,同時接種MLF不僅大大地縮短了發(fā)酵時間,而且揮發(fā)性化合物種類多、含量高,豐富了葡萄酒酒體香氣品質;綜合感官評價分析,本土O.oeniGF-2菌株同時接種MLF釀造酒樣中酯類和萜烯類化合物相對較高,賦予葡萄酒濃郁的花果香,具有一定的應用開發(fā)潛力。