潘麒，蔣立人 ，陳思騰，高峰

（1上海市第一人民醫(yī)院泌尿外科；2上海市第一人民醫(yī)院病理科，上海200080）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，居我國(guó)所有男性惡性腫瘤的第7位[1]。膀胱癌可以分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC）和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer, MIBC）。根治性全膀胱切除術(shù)和基于順鉑藥物的輔助化療是MIBC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案[2,3]。順鉑的作用方式是通過與DNA相互作用，激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并最終激活細(xì)胞凋亡[4]。然而，仍有約一半的MIBC患者在標(biāo)準(zhǔn)方案治療后仍會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)[2,3]。目前，對(duì)于全膀胱癌術(shù)后的輔助化療是否有療效存在一定的爭(zhēng)議[5]。

目前已知多于80%的p53突變是發(fā)生在DNA綁定區(qū)，突變的p53與腫瘤成長(zhǎng)有密切的關(guān)聯(lián)[6,7]。p63目前尚未發(fā)現(xiàn)突變型，其結(jié)構(gòu)相較于p53要穩(wěn)定的多[8]?，F(xiàn)已知p63的異型結(jié)構(gòu)是N端截短p63（N-terminal truncated p63, ΔNp63）[6]。野生型p53和p63是重要的抑癌基因，其主要受到癌基因MDM2和MDMX的調(diào)控[6]。突變型p53和ΔNp63能競(jìng)爭(zhēng)性拮抗并抑制野生型p53和p63[7]。目前已知突變型p53是尿路上皮性膀胱癌常見的致癌基因[9]。研究發(fā)現(xiàn)突變型p53在MIBC中過度表達(dá)，可作為膀胱尿路上皮癌進(jìn)展的標(biāo)志之一[2]。另外p63的表達(dá)對(duì)于尿路上皮癌和鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展亦有相關(guān)性[9,10]。

Ki67是獨(dú)立的預(yù)后因素，其陽性的惡性細(xì)胞比例與腫瘤進(jìn)展以及患者預(yù)后相關(guān)[11,12]。已有研究提示Ki67和膀胱癌預(yù)后存在相關(guān)性，高Ki67指數(shù)提示膀胱癌不良預(yù)后[13~15]。

資料與方法

1 臨床資料

回顧性收集2007年1月至2016年12月在上海第一人民醫(yī)院行根治性全膀胱切除術(shù)+尿流改道術(shù)患者99例。所有患者均為術(shù)后病理診斷為T2~4N0M0、 既往無其他腫瘤病史和除術(shù)后輔助化療外未接受其他放化療。

2 免疫組織化學(xué)染色

送檢標(biāo)本均由福爾馬林充分固定并脫水及石蠟包埋。先蘇木素-伊紅（HE）染色，后另行EnVision法免疫組織化學(xué)標(biāo)記對(duì)突變型p53、p63和Ki67，所有免疫組織化學(xué)染色均設(shè)陰性、陽性對(duì)照。HE染色試劑以及免疫組織化學(xué)抗體突變型p53、p63和Ki67均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。所有HE及免疫組織化學(xué)切片均由在Olympus BX600顯微鏡下觀察并采集圖像。

3 結(jié)果判讀

本研究先閱覽HE切片明確為MIBC診斷，隨后由2位病理科醫(yī)師對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立判讀。本研究免疫組織化學(xué)判讀的突變型p53、p63和Ki67 陽性為細(xì)胞核著色，胞漿和胞膜著色不計(jì)入陽性表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS軟件，進(jìn)行t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)對(duì)兩組間的因素進(jìn)行比較分析；采用Kaplan Meier分析各臨床病理因素對(duì)總生存（overall survival, OS）和無病生存（disease-free survival, DFS）概率的影響，生存曲線的顯著性差異檢驗(yàn)用log-rank檢驗(yàn)。單因素生存分析年齡、性別、分期、突變型p53、p63、Ki67和輔助化療。用COX回歸模型（逐步向前）進(jìn)行多因素回歸分析，計(jì)算出調(diào)整過的hazard ratio（HR），評(píng)估影響OS概率和DFS概率的預(yù)后因素。雙側(cè)P＜0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 突變型p53和p63以及Ki67的表達(dá)和MIBC患者預(yù)后的關(guān)系

突變型p53和p63的免疫反應(yīng)陽性表達(dá)定位在膀胱尿路上皮癌的腫瘤細(xì)胞核（圖1A—D）。在68例突變型p53免疫反應(yīng)陽性MIBC患者和31例突變型p53陰性患者中，患者男女性別分布、pT分期、p63表達(dá)、Ki67≥30%陽性表達(dá)、5年OS概率和DFS概率的平均值（圖2A）的差異均沒有顯著性。在73例p63免疫反應(yīng)陽性的MIBC患者和26例p63陰性的患者中，男女性別分布、pT分期、p63的表達(dá)和Ki67表達(dá)、p63陽性患者的5年OS和DFS平均值與p63陰性的患者5年OS和DFS平均值之間（圖2B）無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ki67陽性表達(dá)30%為界的分組提示（圖1E、F），66例Ki67≥30%陽性的患者和33例Ki67< 30%陽性的患者中，患者男女性別分布沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但Ki67≥30%陽性和Ki67< 30%陽性的患者之間的pT分期有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.010）。Ki67≥30%陽性患者的5年OS概率和DFS概率與Ki67< 30%陽性患者的5年OS和DFS之間沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2C）。綜合pT分期、患者年齡和患者接受術(shù)后輔助化療的情況，分別與突變型p53、p63和Ki67并不能作為MIBC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表1）。

表1 綜合多因素分析Tab.1 Multiple Cox regression analysis upon different biomarkers

圖1 EnVision法免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)突變型p53、p63和Ki67在MIBC組織中的表達(dá)。A，突變型p53陽性表達(dá)；B，突變型p53陰性表達(dá)；C，p63陽性表達(dá)；D，p63陰性表達(dá)；E，Ki67陽性≥30%；F，Ki67陽性<30%；比例尺，200μmFig.1 Immunohistochemical staining for the expression of mutant p53, p63 and Ki67 in MIBC tissues. A, mutant p53 positive; B, mutant p53 negative;C, p63 positive; D, p63 negative; E, Ki67 positive rate more than 30%; F, Ki67 positive rate less than 30%; scale bar, 200μm.

2 突變型p53、p63和Ki67綜合表達(dá)與pT的關(guān)系

基于突變型p53、p63和Ki67的表達(dá)均不能作為MIBC患者的預(yù)后提示標(biāo)記物，我們綜合突變型p53、p63和Ki67表達(dá)，提出了綜合判讀指標(biāo)。在33例突變型p53、p63和Ki67陽性≥30%均陽性的綜合陽性（comprehensive positive）組患者和66例突變型p53、p63、Ki67陽性≥30%非均陽性（至少一個(gè)指標(biāo)陰性）的綜合陰性（comprehensive negative）組患者中，陽性組患者的5年OS和DFS顯著差于陰性組的患者（P=0.024，P=0.009）（表2，圖2D）。另外，綜合pT分期、患者年齡和患者術(shù)后輔助化療情況以及突變型p53陽性/p63陽性/Ki67陽性≥30%的多因素分析，我們發(fā)現(xiàn)突變型p53陽性/p63陽性/Ki67陽性≥30%是MIBC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表3）。

表2 突變型p53、p63和Ki67陽性綜合表達(dá)與MIBC臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between the comprehensive expression of mutant p53, p63, Ki67 and the clinicopathological characteristics of MIBC patients

表3 突變型p53、p63和Ki67陽性綜合表達(dá)的多因素分析Tab.3 Multiple Cox regression analysis of the comprehensive expression of mutant p53, p63 and Ki67

圖2 突變p53、p63和Ki67陽性≥30%表達(dá)與DFS概率關(guān)系分析。A，突變型p53表達(dá)；B，p63表達(dá)；C，Ki67陽性≥30%表達(dá)；D，綜合表達(dá)Fig. 2 Analysis for the relationship of the expression level of mutant p53, p63 and Ki67 with the DFS of MIBC patients. A, mutant p53 expression; B,p63 expression; C, Ki67 expression; D, comprehensive expression

3 突變型p53、p63和Ki67陽性的綜合表達(dá)與術(shù)后輔助化療預(yù)后的關(guān)系

術(shù)后輔助化療對(duì)于MIBC患者的作用一直存在爭(zhēng)議，在本次研究的99例MIBC患者中發(fā)現(xiàn)55例患者在術(shù)后接受了輔助化療。接受術(shù)后化療的MIBC患者5年OS概率和DFS概率沒有顯著優(yōu)于未接受術(shù)后化療的患者（圖3A、B），但發(fā)現(xiàn)綜合陽性組患者其化療后5年OS概率和DFS概率顯著提高，而綜合陰性組患者的化療后5年OS率和DFS率反而略有下降（圖3C、D）。

圖3 突變型p53、p63和Ki67陽性的綜合表達(dá)對(duì)輔助化療預(yù)后的影響。A，輔助化療OS概率；B， 輔助化療DFS概率；C，突變型p53、p63、Ki67陽性綜合表達(dá)輔助化療OS概率；D， 突變型p53、p63、Ki67陽性綜合表達(dá)輔助化療DFS概率Fig. 3 Effect of the comprehensive positive expression of mutant p53, p63 and Ki67 on the prognosis of patients with adjuvant chemotherapy. A. OS of patients with adjuvant chemotherapy; B, DFS of patients with adjuvant chemotherapy; C, effect of the comprehensive positive expression of mutant p53, p63 and Ki67 on the OS of patients with adjuvant chemotherapy; D, effect of the comprehensive positive expression of mutant p53, p63 and Ki67 on the DFS of patients with adjuvant chemotherapy

討 論

本研究主要發(fā)現(xiàn)突變型p53、p63和Ki67的綜合運(yùn)用對(duì)于MIBC患者的預(yù)后有提示作用，同時(shí)該綜合運(yùn)用對(duì)于術(shù)后輔助化療的療效判斷有一定的指導(dǎo)作用，可以為MIBC患者的術(shù)后輔助化療提供參考。

首先通過對(duì)臨床病理膀胱尿路上皮癌常用的免疫組織化學(xué)標(biāo)記物突變型p53和p63的分析。突變型p53是順鉑的作用靶點(diǎn)[4]。順鉑的凋亡活性需要通過產(chǎn)生活性氧來啟動(dòng)p53介導(dǎo)的通路[16]。同時(shí)，順鉑能恢復(fù)p53功能，增強(qiáng)患者對(duì)放療的敏感性[16]。另外，p53還能與順鉑損傷的DNA分子相互作用從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用[16~18]。我們沒有發(fā)現(xiàn)突變型p53和p63對(duì)于MIBC患者的預(yù)后有明確的參考作用。同時(shí)，研究未發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的突變型p53和p63的表達(dá)情況對(duì)于MIBC患者術(shù)后輔助化療的療效上有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Ki67也是一種臨床上常用的診斷MIBC的輔助標(biāo)記物，其高表達(dá)提示細(xì)胞的高增殖，也進(jìn)一步提示腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)情況[19]。然而，COX回歸生存分析沒有提示Ki67高表達(dá)和MIBC患者預(yù)后不佳有關(guān)。不過Ki67的高表達(dá)和pT分期存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，Ki67大于等于30%陽性的患者，其術(shù)后接受輔助化療的5年OS和DFS沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

因此，我們需要一種綜合標(biāo)記物，既能提示患者預(yù)后，也能提示患者術(shù)后化療有效性的標(biāo)記物。因此，在綜合常用MIBC免疫組化診斷標(biāo)記物的基礎(chǔ)上，本研究提出綜合突變型p53和p63均陽性且Ki67陽性表達(dá)≥30%為MIBC預(yù)后和術(shù)后輔助化療的新指標(biāo)。該指標(biāo)不僅可以提示MIBC患者的5年OS和DFS，并且可以為MIBC患者術(shù)后輔助化療療效的提供預(yù)測(cè)，可以減少不必要的過度治療，并提高患者生存率。同時(shí)，由于是常用免疫組織化學(xué)診斷標(biāo)記物，可以節(jié)省患者不必要的額外支出，在經(jīng)濟(jì)和實(shí)用的同時(shí)為臨床MIBC的治療提供行之有效的指標(biāo)。

綜上，本次研究綜合臨床MIBC常用的免疫標(biāo)記物突變型p53、p63和Ki67的表達(dá)和臨床指標(biāo)的綜合分析，發(fā)現(xiàn)綜合運(yùn)用突變型p53、p63和Ki67的指標(biāo)預(yù)測(cè)MIBC患者的OS和DFS，并且為MIBC患者的術(shù)后輔助化療提供預(yù)測(cè)。