安 敏，王帥道，袁東燁，何靚男

(電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬綿陽(yáng)醫(yī)院·綿陽(yáng)市中心醫(yī)院燒傷整形外科，四川 綿陽(yáng) 621000)

虎杖苷是植物虎杖的提取物，主要作用包括鎮(zhèn)咳、去痰、平喘、抗菌、清除自由基、調(diào)節(jié)血脂和降低膽固醇等[1-2]。本研究探討了虎杖苷通過(guò)SPOCK2表達(dá)對(duì)新生小鼠高氧肺損傷的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：SCR20B型冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司)；Mx3000P型Real time PCR儀器(美國(guó)Agilent公司)；DF-23B型凝膠掃描系統(tǒng)(英國(guó)UVP公司)；ABI9700型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)；UV-1206型分光光度計(jì)(日本SHIMODZU公司)；GDS7600型水平式電泳儀(北京東方儀器廠)。

1.1.2 藥品：虎杖苷購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，用DMSO溶液充分溶解，再稀釋成所需的濃度。

1.1.3 試劑：小鼠正常肺上皮細(xì)胞mlE-12(美國(guó)ATCC公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技研究所；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購(gòu)自大連寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理與分組：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠正常肺上皮細(xì)胞mlE-12，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)，用傳代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。正常培養(yǎng)的mlE-12細(xì)胞作為對(duì)照組；利用高氧刺激mlE-12細(xì)胞作為高氧組。用50、100和150 μmol/ml虎杖苷處理mlE-12細(xì)胞，再用高氧刺激，作為高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組。將pcDNA、pcDNA-SPOCK2轉(zhuǎn)染至mlE-12細(xì)胞，再用高氧刺激細(xì)胞，作為高氧+pcDNA組、高氧+pcDNA-SPOCK2組。將si-NC、si-SPOCK2轉(zhuǎn)染至mlE-12細(xì)胞，高氧刺激后，再用高劑量(150 μmol/ml)虎杖苷處理細(xì)胞，作為高氧+高劑量+si-NC組、高氧+高劑量+si-SPOCK2組。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子水平：各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，提取上清液，ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒的詳細(xì)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞MDA含量和SOD活性：各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，提取上清液，MDA含量采用改良的硫代巴比妥酸法測(cè)定，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞SPOCK2 mRNA表達(dá)：各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行PCR，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。SPOCK2以GAPDH為內(nèi)參，SPOCK2上游引物為5′-CCATCGG TTGGATGTTCTCT-3′，下游引物為5′-TGTAGGTGTCGCA GGAGTTG-3′；GAPDH上游引物為5′-GCCCAGCAAGGATA CTGAGA-3′，下游引物為5′-GGGTGCAGCGAACTTTATTG-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)SPOCK2 蛋白質(zhì)表達(dá)：各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加入RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量。進(jìn)行SDS-PAGE電泳并分離蛋白，將分離的蛋白在轉(zhuǎn)至PVDF膜上，于封閉液中封閉2 h。TBST洗滌后加入相應(yīng)一抗，SPOCK2一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃過(guò)夜孵育，再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫(25 ℃)孵育2 h，TBST洗滌后，加入ECL試劑進(jìn)行顯色，于暗室顯影、定影，使用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，將β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各組蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷對(duì)新生小鼠高氧肺細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照組比較，高氧組細(xì)胞的MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高氧組比較，高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞的MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 虎杖苷對(duì)新生小鼠高氧肺細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Tab 1 Effect of polydatin on oxidative stress of hyperoxic lung cells in neonatal n=9)

2.2 虎杖苷對(duì)新生小鼠高氧肺細(xì)胞炎癥因子的影響

與對(duì)照組比較，高氧組細(xì)胞的TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高氧組比較，高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞的TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 虎杖苷對(duì)新生小鼠高氧肺細(xì)胞炎癥因子的影響Tab 2 Effect of polydatin on inflammatory factors of hyperoxic lung cells in neonatal n=9，pg/ml)

2.3 虎杖苷對(duì)新生小鼠高氧肺細(xì)胞SPOCK2表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，高氧組細(xì)胞的SPOCK2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高氧組比較，高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞的SPOCK2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 相關(guān)蛋白表達(dá)圖Fig 1 Diagram of expression of related protein

表3 虎杖苷對(duì)新生小鼠高氧肺細(xì)胞SPOCK2表達(dá)的影響Tab 3 Effect of polydatin on the expression of SPOCK2 of hyperoxic lung cells in neonatal n=9)

2.4 SPOCK2過(guò)表達(dá)對(duì)新生小鼠高氧肺細(xì)胞損傷的影響

與高氧+pcDNA組比較，高氧+pcDNA-SPOCK2細(xì)胞的MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低，SOD活性顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 SPOCK2過(guò)表達(dá)對(duì)新生小鼠高氧肺細(xì)胞損傷的影響Tab 4 Effects of the over-expression of SPOCK2 on hyperoxia lung cell damage in neonatal mice n=9)

2.5 抑制SPOCK2表達(dá)對(duì)虎杖苷用于新生小鼠高氧肺細(xì)胞損傷的影響

與高氧+高劑量+si-NC組比較，高氧+高劑量+si-SPOCK2組細(xì)胞的MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高，SOD活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 抑制SPOCK2表達(dá)對(duì)虎杖苷用于新生小鼠高氧肺細(xì)胞損傷的影響Tab 5 Effects of the inhibition of expression of SPOCK2 on hyperoxia lung cell damage in neonatal mice n=9)

3 討論

虎杖苷是從中藥虎杖的干燥根莖中提取的第4種單體，屬于芪類化合物，虎杖苷對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有一定的治療效果，可起到保護(hù)肺部的作用。有研究結(jié)果表明，虎杖苷可以減輕肺部的病理?yè)p傷情況，抑制大鼠肺部氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制大鼠肺炎癥介質(zhì)釋放[3]。張新彧等[4]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎杖苷對(duì)百草枯中毒造成的大鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用。曹媛媛等[5]的研究結(jié)果認(rèn)為，虎杖苷通過(guò)上調(diào)線粒體自噬，可以顯著改善氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷。鄧加雄等[2]的研究結(jié)果顯示，虎杖苷通過(guò)激活SIRT3，可以顯著改善脂多糖誘導(dǎo)的肺泡上皮線粒體損傷。曹堃[6]的研究結(jié)果顯示，虎杖苷能夠有效緩解電離輻射誘導(dǎo)的小鼠肺組織病理改變，減輕肺水腫?；⒄溶者€可以減少小鼠炎癥細(xì)胞因子的釋放，發(fā)揮放射性肺損傷防護(hù)作用。王雷琛等[7]的研究結(jié)果顯示，虎杖苷可降低肺MDA含量，提高SOD活性，抑制肺組織中TNF-α、IL-6水平，從而減輕小鼠在高原缺氧環(huán)境下的肺組織損傷。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，高氧組細(xì)胞MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低；與高氧組比較，高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高。與對(duì)照組比較，高氧組細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高；與高氧組比較，高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低。

SPOCK2表達(dá)與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有研究報(bào)道，SPOCK2基因與支氣管肺發(fā)育不良具有非常重要的關(guān)系[8-10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，高氧組細(xì)胞SPOCK2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低；與高氧組比較，高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞SPOCK2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高。陳濤等[11]的研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，高氧組大鼠肺組織中SPOCK2 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低。張媛[12]的研究結(jié)果表明，LncRNANANCI-NKX2.1信號(hào)通路下調(diào)可能參與高氧誘導(dǎo)新生小鼠肺損傷的發(fā)病機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，與高氧+高劑量+si-NC組比較，高氧+高劑量+si-SPOCK2組細(xì)胞的MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高，SOD活性顯著降低。抑制SPOCK2表達(dá)逆轉(zhuǎn)了虎杖苷對(duì)新生小鼠高氧肺細(xì)胞損傷的抑制作用，使氧化應(yīng)激和炎癥因子水平升高。說(shuō)明虎杖苷通過(guò)上調(diào)SPOCK2表達(dá)，抑制新生小鼠高氧肺損傷。類似研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺通過(guò)ERS途徑減輕高氧誘導(dǎo)新生大鼠肺組織水腫及炎癥反應(yīng)[13]。朱曉丹[14]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過(guò)降低活性氧和p53的表達(dá)，減輕高氧誘導(dǎo)的新生大鼠肺組織凋亡。

綜上所述，虎杖苷通過(guò)上調(diào)SPOCK2表達(dá)抑制新生小鼠高氧肺損傷，對(duì)肺部具有保護(hù)作用。