史聰聰，張鵬

（1.山東省淄博職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，山東 淄博 255300；2.解放軍第960醫(yī)院淄博院區(qū) 急診科/重癥醫(yī)學(xué)科，山東 淄博 255300）

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康飼養(yǎng)家兔20只，體重3.0～4.0 kg，雌雄均可，由淄博職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供[1-2]。

1.2 生物羊膜

不同于傳統(tǒng)的凍干生物羊膜，選取新鮮胎盤羊膜，由解放軍第960醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。簽知情同意協(xié)議書，選用健康產(chǎn)婦的新遺棄胎盤（血項(xiàng)指標(biāo)、傳染性疾病指標(biāo)均正常），從中鈍性分離出胎膜，將胎膜用蒸餾水清洗干凈，然后將羊膜面朝下平鋪于無菌塑料薄片上分離掉羊膜的絨毛膜，獲取羊膜，用生理鹽水反復(fù)沖洗3遍，放入0.1%新潔爾滅液浸泡10 min，用無菌生理鹽水沖洗2次，置入0.2%戊二醛溶液中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹3]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

手術(shù)前家兔禁食稱重，避免受驚嚇。經(jīng)耳緣靜脈應(yīng)用3%戊巴比妥鈉按照30 mg/kg靜推麻醉。將兔置于俯臥位，選右后肢備皮，左側(cè)保留術(shù)后活動(dòng)。常規(guī)碘伏消毒3遍。取后肢上段背內(nèi)側(cè)直切口，依次切開皮膚及皮下組織，兩側(cè)游離暴露后肢屈肌群，沿肌間隙鈍性分離，找坐骨神經(jīng)，再向兩端游離，拉鉤固定兩側(cè)肌肉組織。切斷右下肢坐骨神經(jīng)，保留左下肢活動(dòng)。在顯微鏡下以9-0無創(chuàng)尼龍單線給予坐骨神經(jīng)行神經(jīng)外膜+束膜縫合。實(shí)驗(yàn)組在神經(jīng)吻合后以吻合口為中心包裹羊膜3 cm，對照組吻合神經(jīng)后不用羊膜包裹。縫合軟組織皮膚后傷口給予碘伏消毒后包扎。以上手術(shù)由解放軍第960醫(yī)院急診科/ICU主治醫(yī)師張鵬、淄博職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院教師史聰聰共同完成。術(shù)后給予家兔右下肢鋁塑板固定制動(dòng)，按照3 d換藥1次，14 d傷口拆線。家兔籠中可靠左下肢適當(dāng)活動(dòng)，第12周給予肌電圖和神經(jīng)電生理檢測，并記錄。于12周行第二次手術(shù)，將吻合坐骨神經(jīng)截?cái)嗳〕? cm（遠(yuǎn)近段各2.5 cm并標(biāo)記），石蠟包埋處理后在顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)吻合口瘢痕形成的情況。

在神經(jīng)吻合口遠(yuǎn)端0.3～0.5 cm處橫切片，HE染色，顯微觀察兩組遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維形態(tài)并計(jì)數(shù)，每張切片觀察10個(gè)視野，結(jié)果取平均值。

1.4 評價(jià)指標(biāo)

1.4.1 肌電圖和神經(jīng)電生理檢測

肌電圖是神經(jīng)功能恢復(fù)的重要客觀指標(biāo)，術(shù)后12周時(shí)暴露并游離坐骨神經(jīng)，將刺激電極置于近端神經(jīng)吻合口處，記錄電極刺入比目魚肌，記錄比目魚肌誘發(fā)電位的波幅和時(shí)限、雙側(cè)坐骨神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNCV）和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNCV），見表1。

1.4.2 坐骨神經(jīng)吻合口處形態(tài)觀察

剝離取出坐骨神經(jīng)，觀察見實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)連續(xù)性好，與周圍組織分離良好，罕見瘢痕粘連，羊膜已降解吸收，吻合口周圍炎癥反應(yīng)不明顯，神經(jīng)表面毛細(xì)血管明顯，未觸及硬結(jié)，少見神經(jīng)瘤。對照組坐骨神經(jīng)與周圍組織粘連明顯，吻合口膨大現(xiàn)瘢痕，且表面毛細(xì)血管少，神經(jīng)瘤多見，1例有直徑約2.4 mm的神經(jīng)瘤形成。

1.4.3 神經(jīng)組織切片觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)纖維生長情況良好，修復(fù)再生后的神經(jīng)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；對照組神經(jīng)纖維生長不甚良好，可見部分恢復(fù)不良的纖維，兩組的神經(jīng)纖維數(shù)見表2。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)結(jié)果采用Students-t檢驗(yàn)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

比目魚肌誘發(fā)電位的波幅和時(shí)限、雙側(cè)坐骨神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNCV）和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNCV），結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于對照組，見表1。

表1 術(shù)后12周各組坐骨神經(jīng)軸突圖像分析結(jié)果（±s）

表1 術(shù)后12周各組坐骨神經(jīng)軸突圖像分析結(jié)果（±s）

比目魚肌誘發(fā)電位 神經(jīng)傳導(dǎo)速度（m·s-1）波幅（mv） 時(shí)限（ms） MNCV SNCV實(shí)驗(yàn)組 10 0.922±0.012 5.419±0.60212.517±1.68536.36±2.203 27.25±4.17對照組 10 0.651±0.182 2.293±0.273 3.945±0.63129.306±0.61522.215±2.76 t-4.674 -14.935 -15.060 -9.761 -4.087 P 0.001 0.000 0.000 0.000 0.002組別 n 軸突密度（根·100 μm-2）

實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)纖維生長情況良好，修復(fù)再生后的神經(jīng)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；對照組神經(jīng)纖維生長不甚良好，可見部分恢復(fù)不良的纖維，兩組的神經(jīng)纖維數(shù)見表2。

表2 各組神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)比較（±s）

表2 各組神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)比較（±s）

組別 神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組 137.75±20.47對照組 112.32±12.75 t 4.193 P 0.001

3 討論

（1）羊膜來源于產(chǎn)婦，取材方便，來源廣泛，因無血管、淋巴和神經(jīng)系統(tǒng)，罕見有排斥性。能抗感染和保護(hù)創(chuàng)面；已有研究顯示羊膜上皮易于上皮化、移行和黏附。其膠原纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)具有良好的柔韌性和迷路管道系統(tǒng)，易于物質(zhì)交換。功能活躍的羊膜上皮細(xì)胞和膠原基質(zhì)中富含多種生物活性物質(zhì)，如LN、EGF、b-FGF、TGF-β、TIMP、IL-10等，能有效抗炎、抗粘連和促進(jìn)組織修復(fù)[4]。

（2）在臨床實(shí)踐中羊膜已用于治療手術(shù)后腹部和盆腔粘連、陰道重建、眼外科手術(shù)[5]、治療慢性皮膚潰瘍和燒傷，其中在解放軍第960醫(yī)院（淄博院區(qū)）應(yīng)用新鮮羊膜在急診科、婦產(chǎn)科和ICU患者的嚴(yán)重皮膚缺損創(chuàng)面、宮頸糜爛[6]、高齡患者褥瘡、糖尿病足的廣泛臨床應(yīng)用并取得良好效果。雖然羊膜對神經(jīng)修復(fù)的研究較少，但人羊膜上皮細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可分化成為神經(jīng)細(xì)胞[7]。這使得羊膜在應(yīng)用在神經(jīng)修復(fù)恢復(fù)期發(fā)揮積極作用成為可能。

（3）周圍神經(jīng)損傷之后，形成瘢痕及纖維化，加之外傷致肌肉軟組織水腫更容易壓迫形成黏連。盡管目前顯微外科技術(shù)發(fā)展成熟，但神經(jīng)修復(fù)恢復(fù)期的周圍環(huán)境極為重要。使用新鮮羊膜可以抑制損傷組織中細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1、腫瘤壞死因子α和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，從而能夠減少肉芽及瘢痕組織的形成[8-9]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，羊膜可誘導(dǎo)TGRP51、P52和P53等在創(chuàng)傷愈合中與成纖維細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)的信號下調(diào)，從而達(dá)到抗纖維化效果[10]。本實(shí)驗(yàn)中，可得到相同的結(jié)果，羊膜包裹受損的神經(jīng)吻合口組在電刺激傳導(dǎo)、形態(tài)修復(fù)各方面明顯優(yōu)于未包裹羊膜組。

綜上所述，羊膜在神經(jīng)修復(fù)過程中發(fā)揮著減少瘢痕黏連并且促使神經(jīng)細(xì)胞再生的作用，在今后的臨床工作中可推薦應(yīng)用新鮮羊膜在創(chuàng)傷患者的神經(jīng)修復(fù)治療環(huán)節(jié)，將改善預(yù)后療效。