李新穎，于星辰，張 舜，王愛(ài)國(guó)，劉 莉△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 1流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系 2勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系環(huán)境與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430030

氟是人體生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量元素，一定劑量的氟攝入可維持機(jī)體正常生理活動(dòng)。

研究表明，過(guò)量氟暴露可引起運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、認(rèn)知和記憶能力的下降，提示過(guò)量的氟攝入可能影響神經(jīng)行為和功能[1-2]。神經(jīng)系統(tǒng)是機(jī)體氧耗量最高的系統(tǒng)，而線粒體是細(xì)胞供能的主要場(chǎng)所[3]，因此研究氟中毒致神經(jīng)細(xì)胞線粒體改變具有重要意義。線粒體呼吸鏈能夠產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，過(guò)量的ROS若未被及時(shí)清除，會(huì)導(dǎo)致線粒體能量代謝衰竭和氧化應(yīng)激[4]。而氟則可能通過(guò)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，損傷線粒體相關(guān)成分從而產(chǎn)生毒性效應(yīng)。

現(xiàn)已有研究報(bào)道氟對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體相關(guān)基因表達(dá)的影響[5-6]，而氟對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能、線粒體動(dòng)力學(xué)和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究氟對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y細(xì)胞)線粒體功能、線粒體動(dòng)力學(xué)和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，對(duì)氟中毒致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDocTMXRS+，Bio-Rad，上海)；流式細(xì)胞儀(CytoFLEX S，Beckman Coulter，美國(guó))；全功能微孔板檢測(cè)儀(PerkinElmer/envision，上海)；熒光顯微鏡(BX53，Olympux，日本)。NaF(Sigma，美國(guó))；Miro1/RHOT1抗體(Invitrogen，美國(guó))；MitoSOX Red檢測(cè)試劑盒(Invitrogen，美國(guó))；ATG5抗體(Invitrogen，美國(guó))；PINK1抗體(Invitrogen，美國(guó))；PARP抗體(Invitrogen，美國(guó))；cleaved Caspase-3抗體(Affinity Biosciences，美國(guó))；Bcl-2抗體(Affinity Biosciences，美國(guó))；GAPDH抗體(普健生物，武漢)；凋亡檢測(cè)試劑盒(Vazyme Biotech，南京)；線粒體跨膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)(Solarbio，北京)；山羊血清(碧云天，上海)；胎牛血清(Hyclone，美國(guó))；DMEM(Hyclone，美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品前處理

實(shí)驗(yàn)所用SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自ATCC，凍存于液氮中備用，復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

參考已發(fā)表的氟暴露與神經(jīng)系統(tǒng)損傷相關(guān)研究[7-8]，設(shè)定NaF染毒劑量為20、40、60 mg/L。配制4 mg/mL的NaF儲(chǔ)備液，進(jìn)一步用DMEM培養(yǎng)液依次稀釋為20、40、60 mg/L NaF處理液，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 線粒體跨膜電位(ΔΨm)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組和20、40、60 mg/L NaF染毒劑量組。細(xì)胞按照對(duì)應(yīng)劑量進(jìn)行NaF染毒后，放入5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)24 h。收集細(xì)胞懸液，離心后棄去上清。加入1 mL JC-1(1×)，37 ℃避光孵育20 min。1 mL預(yù)冷染色緩沖液(1×)洗2次。加入300 μL PBS后進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.3.2 線粒體內(nèi)活性氧(MitoROS)水平檢測(cè) 細(xì)胞按照對(duì)應(yīng)劑量進(jìn)行NaF染毒后，放入5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)24 h。收集細(xì)胞懸液，離心后棄去上清。PBS洗1次。用PBS將5 mmol/L Mito-SOX Red探針儲(chǔ)液稀釋1000倍(工作濃度不超過(guò)5 μmol/L)。每組加入1000 μL工作液，37 ℃避光孵育10 min后進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.3.3 Western blot檢測(cè)Miro1(RHOT1)、ATG5、PINK1、PARP、cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá) 細(xì)胞按分組染毒24 h后，收集細(xì)胞提取蛋白。采用BCA法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。取各組蛋白樣品經(jīng)12% SDS分離膠電泳分離，然后將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉。加入稀釋的一抗(Miro1、ATG5和PINK1稀釋度為1∶600；其余一抗稀釋度均為1∶1000)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST溶液漂洗3次，加入1∶5000稀釋的二抗，室溫孵育1 h。PBST溶液漂洗3次，在凝膠成像系統(tǒng)中以化學(xué)發(fā)光法顯色，采集圖像。

1.3.4 免疫熒光檢測(cè)Miro1、ATG5和PINK1蛋白與線粒體共定位情況 各組細(xì)胞按照對(duì)應(yīng)劑量進(jìn)行NaF染毒后，放入5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48～72 h。向培養(yǎng)液中加入線粒體探針MitoTracker Red CMXRos，使之終濃度為0.5 μmol/L，培養(yǎng)箱避光孵育30 min后吸棄培養(yǎng)液。PBS緩沖液輕柔洗滌3次，加入500 μL 4%多聚甲醛溶液，室溫下放置15 min，再次以PBS緩沖液輕柔洗滌3次，加入500 μL 0.5%曲拉通-100，室溫下放置20 min，再次以PBS緩沖液輕柔洗滌3次，加入500 μL山羊血清，室溫下放置30 min。接著進(jìn)行抗體孵育，一抗、二抗稀釋比均為1∶50。PBST溶液漂洗3次，加入DAPI染液，避光放置5 min。PBST溶液漂洗4次，吸干殘液，取出爬片，置于含防熒光淬滅劑的封片上，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，采集圖像。

1.3.5細(xì)胞凋亡檢測(cè) 各組細(xì)胞按照對(duì)應(yīng)劑量進(jìn)行NaF染毒后，放入5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)24 h。收集細(xì)胞懸液，離心后棄去上清，加入1×結(jié)合緩沖液100 μL重懸細(xì)胞。向其中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC染液，室溫下避光放置10 min，繼續(xù)加入PI染液5 μL，室溫條件下避光放置約15 min。隨后補(bǔ)加1×結(jié)合緩沖液150 μL，上機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NaF對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能的影響

本研究采用ΔΨm和MitoROS兩個(gè)指標(biāo)來(lái)反映氟中毒對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能的影響。與對(duì)照組比較，20、40和60 mg/L NaF染毒組的ΔΨm相對(duì)水平分別為36.07%、23.83%和11.22%，均明顯降低(均P<0.01)，且隨著氟染毒劑量的增加，ΔΨm呈下降趨勢(shì)(P<0.01)。相對(duì)于對(duì)照組，20、40和60 mg/L NaF染毒組的MitoROS相對(duì)水平分別為131.45%、179.23%和202.05%，均明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)，且隨著氟處理濃度的增加呈上升趨勢(shì)(P<0.05)(圖1)。

1：對(duì)照組；2：NaF 20 mg/L；3：NaF 40 mg/L；4：NaF 60 mg/L；*P<0.05 **P<0.01圖1 經(jīng)NaF處理后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ΔΨm(A)、MitoROS水平(B)變化Fig.1 Levels of ΔΨm(A)and MitoROS(B)in SH-SY5Y cells after treatment with NaF

2.2 NaF對(duì)線粒體動(dòng)力學(xué)和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Miro1、ATG5和PINK1這3個(gè)線粒體動(dòng)力學(xué)和自噬相關(guān)蛋白指標(biāo)來(lái)反映氟中毒對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)和自噬的影響。與對(duì)照組相比，Miro1、ATG5和PINK1在40和60 mg/L NaF處理組的表達(dá)水平均顯著提高(均P<0.01)，且隨著氟染毒劑量的增加，蛋白表達(dá)均呈上升趨勢(shì)(P<0.05)(圖2)。

1：對(duì)照組；2：NaF 20 mg/L；3：NaF 40 mg/L；4：NaF 60 mg/L；A～C：分別為Miro1(A)、ATG5(B)和PINK1(C)的蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)；D：蛋白電泳條帶；# P<0.05；與對(duì)照組比較，**P<0.01圖2 經(jīng)NaF處理后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)線粒體動(dòng)力學(xué)和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化Fig.2 Expression levels of mitochondrial dynamics-related and autophagy-related proteins in SH-SY5Y cells after treatment with NaF

在細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)中，3個(gè)蛋白被綠色熒光蛋白標(biāo)記，利用MitoTracker Red CMXRos探針和DAPI進(jìn)行線粒體和胞核雙染，以觀察蛋白與線粒體的共定位狀態(tài)。隨著氟染毒劑量的增加，Miro1、ATG5和PINK1蛋白的熒光斑點(diǎn)逐漸增強(qiáng)，數(shù)量增加，且不斷向線粒體內(nèi)聚集，提示過(guò)量氟可導(dǎo)致Miro1、ATG5和PINK1線粒體動(dòng)力學(xué)和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增加，并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)入線粒體，從而促進(jìn)其在線粒體內(nèi)發(fā)揮作用，如激活自噬相關(guān)分子生物學(xué)過(guò)程和誘導(dǎo)凋亡等。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果(圖3～5)與Western blot蛋白定量結(jié)果一致。

綠色熒光為標(biāo)記的Miro1蛋白；紅色熒光為MitoTracker Red CMXRos探針標(biāo)記的線粒體；藍(lán)色熒光為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；Rr為Pearson相關(guān)系數(shù)圖3 經(jīng)NaF處理后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Miro1蛋白與線粒體共定位情況Fig.3 Colocalization of Miro1 and mitochondria in SH-SY5Y cells after treatment with NaF

綠色熒光為標(biāo)記的ATG5蛋白；紅色熒光為MitoTracker Red CMXRos探針標(biāo)記的線粒體；藍(lán)色熒光為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；Rr為Pearson相關(guān)系數(shù)圖4 經(jīng)NaF處理后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATG5蛋白與線粒體共定位情況Fig.4 Colocalization of ATG5 and mitochondria in SH-SY5Y cells after treatment with NaF

綠色熒光為標(biāo)記的PINK1蛋白；紅色熒光為MitoTracker Red CMXRos探針標(biāo)記的線粒體；藍(lán)色熒光為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；Rr為Pearson相關(guān)系數(shù)圖5 經(jīng)NaF處理后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)PINK1蛋白與線粒體共定位情況Fig.5 Colocalization of PINK1 and mitochondria in SH-SY5Y cells after treatment with NaF

2.3 NaF對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)凋亡率、凋亡蛋白PARP和cleaved Caspase-3及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)來(lái)反映氟中毒對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。細(xì)胞早期凋亡率在對(duì)照組為2.58%，在40和60 mg/L NaF染毒組則分別為6.89%和8.36%，明顯高于對(duì)照組(均P<0.01)，且隨著氟濃度的增加呈上升趨勢(shì)(P<0.05)；對(duì)照組細(xì)胞總凋亡率為3.14%，40和60 mg/L NaF染毒組總凋亡率則分別為8.57%和11.70%，明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，且隨著氟劑量的增加呈升高趨勢(shì)(P<0.05)(圖6)。與對(duì)照組相比，60 mg/L NaF處理組凋亡蛋白PARP的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表達(dá)在40和60 mg/L NaF染毒組均有所提高(均P<0.05)，且隨著氟染毒濃度的增加呈上升趨勢(shì)(P<0.05)；抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)情況則相反，隨著氟染毒劑量的增加，Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)(P<0.05)，與對(duì)照組相比，40和60 mg/L NaF染毒組Bcl-2表達(dá)量明顯降低(均P<0.01)(圖7)。

1：對(duì)照組；2：NaF 20 mg/L；3：NaF 40 mg/L；4：NaF 60 mg/L；**P<0.01圖6 經(jīng)NaF處理后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況Fig.6 Apoptosis rates of SH-SY5Y cells after treatment with NaF

1：對(duì)照組；2：NaF 20 mg/L；3：NaF 40 mg/L；4：NaF 60 mg/L；A～C：分別為PARP、cleaved Caspase-3和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)；D：蛋白電泳條帶；與對(duì)照組比較，*P<0.05 **P<0.01圖7 經(jīng)NaF處理后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of apoptosis-related proteins in SH-SY5Y cells after treatment with NaF

3 討論

本研究通過(guò)檢測(cè)經(jīng)不同濃度NaF處理后SH-SY5Y細(xì)胞線粒體功能、線粒體動(dòng)力學(xué)和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化及細(xì)胞凋亡情況，探討過(guò)量氟暴露對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)NaF處理后SH-SY5Y細(xì)胞ΔΨm下降，MitoROS水平上升，線粒體動(dòng)力學(xué)和自噬相關(guān)蛋白(Miro1、ATG5和PINK1)表達(dá)上升并向線粒體內(nèi)聚集，細(xì)胞凋亡率增加，凋亡蛋白(PARP和cleaved Caspase-3)表達(dá)上升，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降。且隨著NaF濃度增加，上述各指標(biāo)變化程度增加。

線粒體是由雙層膜圍成的囊狀結(jié)構(gòu)，線粒體基質(zhì)內(nèi)的質(zhì)子泵出，進(jìn)入線粒體膜間隙，即形成ΔΨm。正常的ΔΨm是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的先決條件[9]。ΔΨm可反映線粒體內(nèi)膜通透性，線粒體內(nèi)膜通透性增加、ΔΨm改變是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的早期事件[10]。隨著NaF濃度增加，SH-SY5Y細(xì)胞ΔΨm明顯下降，表明過(guò)量氟暴露誘導(dǎo)了線粒體功能障礙，而細(xì)胞在早期凋亡時(shí)均有ΔΨm的下降[11]，因此ΔΨm降低提示SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生了早期凋亡，這與流式檢測(cè)凋亡的結(jié)果一致。MitoROS水平可反映細(xì)胞氧化應(yīng)激的程度，ROS生成增加可引發(fā)神經(jīng)元突觸功能減退及神經(jīng)元死亡[12]。本研究中，隨著NaF濃度增加，SH-SY5Y細(xì)胞MitoROS水平呈上升趨勢(shì)，表明氟化物可能通過(guò)氧化應(yīng)激途徑損傷神經(jīng)細(xì)胞。

神經(jīng)系統(tǒng)是機(jī)體氧耗量最高的系統(tǒng)，線粒體不斷在胞體和軸突之間轉(zhuǎn)運(yùn)和重新分布，對(duì)于維持神經(jīng)元的正常代謝活動(dòng)非常重要。Miro1為線粒體銜接蛋白，可調(diào)控線粒體沿微管的移動(dòng)[13]，將受損線粒體逆行運(yùn)送至胞體，從而被降解和回收，同時(shí)將正常線粒體順向運(yùn)送至神經(jīng)元的功能部位，降低氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮正常功能[14]。在氧化應(yīng)激環(huán)境下，受損的線粒體可啟動(dòng)自噬過(guò)程，被包裹入自噬體中，經(jīng)溶酶體途徑完成降解過(guò)程，達(dá)到及時(shí)清除受損線粒體和異常蛋白等成分的目的，對(duì)維持線粒體正常功能和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有重要意義[15]。自噬蛋白ATG5可與ATG家族其他蛋白結(jié)合為復(fù)合體，通過(guò)PERK等信號(hào)通路發(fā)揮自噬作用[16]，PINK1則可招募E3泛素鏈接酶Parkin，通過(guò)PINK1/Parkin通路作用于Miro1發(fā)揮線粒體移動(dòng)作用或啟動(dòng)線粒體自噬[17-18]。自噬的作用具有雙向性，適度的自噬有助于受損成分的清除和重新利用，促進(jìn)細(xì)胞生存；但在氧化應(yīng)激等損傷過(guò)度情況下，自噬則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[19]。隨著NaF濃度增加，SH-SY5Y細(xì)胞Miro1、ATG5和PINK1的表達(dá)水平均升高，說(shuō)明線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)和自噬活動(dòng)增強(qiáng)，提示線粒體可能通過(guò)增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)和自噬來(lái)代償性地保護(hù)神經(jīng)元功能，但也要注意過(guò)度自噬可能會(huì)加重?fù)p傷從而誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡。

PARP和Caspase-3在細(xì)胞凋亡中具有重要作用。當(dāng)存在低水平DNA損傷時(shí)，PARP活化后可促進(jìn)細(xì)胞存活，然而當(dāng)存在廣泛DNA損傷時(shí)，PARP過(guò)度激活將導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。Caspase-3活化后可成為cleaved Caspase-3，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，這一過(guò)程在一定程度上可被抗凋亡蛋白Bcl-2阻斷。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著NaF濃度增加，SH-SY5Y細(xì)胞PARP和Caspase-3表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，提示過(guò)量氟化物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。并且流式檢測(cè)出SH-SY5Y細(xì)胞早期凋亡率、總凋亡率均上升，與之一致。

綜上所述，在體外SH-SY5Y細(xì)胞染毒實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)在不同氟染毒劑量下線粒體跨膜電位、氧化應(yīng)激水平、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)和自噬水平以及細(xì)胞凋亡情況，提示氟暴露可能通過(guò)促進(jìn)線粒體的氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)運(yùn)和自噬而參與神經(jīng)損傷。本研究有助于闡明線粒體在氟暴露所致神經(jīng)損傷中的作用機(jī)制，為尋找氟神經(jīng)毒性潛在的早期效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志及對(duì)氟神經(jīng)毒性的早期干預(yù)提供新思路。