張韶輝，劉劍敏，胡 松

武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022

乳腺癌的發(fā)病率近十年在全球呈上升趨勢(shì)[1-2]。在發(fā)展中國(guó)家，乳腺癌是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[3]。對(duì)于早期乳腺癌會(huì)采用手術(shù)、化療、放療等治療手段，乳腺癌患者的平均生存率正在逐漸提高，但仍然有30%～40%的乳腺癌會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移[4]。

PPARγ共激活劑1α(PGC-1α)屬于轉(zhuǎn)錄輔激活因子(PPARg coactivators，PGC)家族，在調(diào)節(jié)線粒體生物合成和能量代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。研究證實(shí)，PGC-1α不僅在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，而且可能作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[6-7]。microRNAs(miRNAs)是一組進(jìn)化保守的非編碼小RNA，其功能是通過結(jié)合位于靶基因3′非翻譯區(qū)(3′UTR)的互補(bǔ)DNA序列來(lái)抑制下游靶基因的表達(dá)。miRNA已被證明在人類乳腺癌的發(fā)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等過程的調(diào)控中起關(guān)鍵作用[8]。此外，miRNAs誘導(dǎo)了乳腺癌中的各種下游信號(hào)通路，如p27 Kip1和NF-κB[9-10]。近期研究證實(shí)，microRNA-217(miR-217)在乳腺癌中高表達(dá)，并且miR-217的表達(dá)抑制對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程具有顯著的抑制作用[11]。

為探明乳腺癌細(xì)胞中miR-217與PGC-1α可能的相互作用與調(diào)控關(guān)系，本研究首次采用雙熒光素酶活性測(cè)定法檢測(cè)miR-217與PGC-1α基因的作用。并以下調(diào)miR-217表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系為對(duì)象，檢測(cè)miR-217對(duì)PGC-1α基因和蛋白表達(dá)的影響。進(jìn)一步通過siRNA敲低miR-217表達(dá)下調(diào)的乳腺癌細(xì)胞中的PGC-1α，探討miR-217靶向調(diào)節(jié)PGC-1α對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7來(lái)源于武漢中科院細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清、miR-217-mimics及陰性對(duì)照(miR-mc)、RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒、MTT試劑盒均購(gòu)自ThermoFisher Scientific公司，miR-217抑制物及陰性對(duì)照購(gòu)自廣州Ribobio公司。雙熒光素酶報(bào)告試劑盒購(gòu)自Promega公司，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自Apple BioSosits公司，PGC-1α抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。Si-PGC-1α、Si-DACH1及其陰性對(duì)照siRNA(Si-C)購(gòu)自GE DeMaCon。

1.2 生物信息學(xué)分析

使用在線miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具TargetScan(www.targetscan.org)對(duì)靶向結(jié)合PGC-1α 3′UTR的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 雙熒光素酶活性測(cè)定

將PGC-1α基因的3′UTR插入到psi-CHECK-2質(zhì)粒海腎熒光素酶基因中，構(gòu)建psi-CHECK-PGC-1α-3′UTR質(zhì)粒。將PGC-1α 3′UTR區(qū)突變，并插入psi-CHECK-2質(zhì)粒中，產(chǎn)生突變psi-CHECK-PGC-1α-mut-3′UTR質(zhì)粒。在體外培養(yǎng)人HEK-293T細(xì)胞中，將miR-217-mimics與PGC-1α-3′UTR或PGC-1α-mut-3′UTR共轉(zhuǎn)染48 h。比較共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

MCF-7細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板上。按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書，將miR-217抑制物(miR-217-inhibitor)或陰性對(duì)照miR-IC及6 μg/mL polybrene與細(xì)胞共孵育。轉(zhuǎn)染72 h之后更換新鮮培養(yǎng)液并傳代1～2周以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效果。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.5 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

使用Trizol提取總RNA，提取后使用NanoDro ND-1100分光光度計(jì)檢測(cè)樣品的濃度與純度。miR-217測(cè)定采用TaqMan microRNA檢測(cè)試劑盒，PGC-1α測(cè)定采用SyBR qRT-PCR檢測(cè)試劑盒，以sonRNU202作為內(nèi)參照。反應(yīng)條件為95℃ 2 min；95℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 10 s，循環(huán)40次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)采用ABI7900 Real-time PCR system進(jìn)行，結(jié)果以2-ΔΔCt進(jìn)行定量分析。

1.6 Western blot法檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)

將蛋白提取緩沖液加入到轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞中，收集其細(xì)胞裂解液并測(cè)定蛋白濃度。將30 mg稀釋的蛋白質(zhì)加樣到0.8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，再電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，用5%的脫脂牛奶在TBST緩沖液中封閉1 h后，分別加入PGC-1α(1∶100)和DACH1(1∶500)一抗，4℃孵育過夜。清洗3次(TBST，每次10 min)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，TBST清洗2次后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行放射自顯影。

1.7 siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)PGC-1α及DACH1

將4×104～5×104個(gè)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板上，根據(jù)試劑說(shuō)明書使用Dharma FECT siRNA轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行PGC-1α siRNA及DACH1 siRNA轉(zhuǎn)染。ON-TARGET plus Non-targeting siRAN作為陰性對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h之后用qRT-PCR法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.8 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞接種于96孔板中(5×103細(xì)胞/孔)，置于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。然后使用Vybrant MTT細(xì)胞增殖測(cè)定法(ThermoFisher Scientific，USA)檢測(cè)590 nm的吸光度值(A590 nm)，以此代表細(xì)胞增殖活力。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

MCF-7細(xì)胞在4℃下用70%的乙醇固定1 h，用200～500 μL預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，加入RNase A溶液20 μL，37 ℃水浴30 min后用50 μg/mL碘化丙啶避光染色1 h，使用Fascalibur流式細(xì)胞儀測(cè)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PGC-1α上游miRNA調(diào)節(jié)因子預(yù)測(cè)

使用microRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan(www.targetscan.org)尋找PGC-1α上游可能的miRNA調(diào)節(jié)因子。候選miRNA的標(biāo)準(zhǔn)是Context++得分大于90%?；诖耍业搅?0個(gè)miRNA候選基因[12-26](表1)。由于PGC-1α在乳腺癌中低表達(dá)，因此需要尋找在癌組織中高表達(dá)，且有研究提示其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中具有致癌作用的miRNA。最終篩選發(fā)現(xiàn)，miR-217很可能是PGC-1α的候選上游調(diào)節(jié)因子，因?yàn)閙iR-17在乳腺癌中被證實(shí)上調(diào)，miR-217的抑制對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231[26]的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展有抑制作用。

表1 PGC-1α可能的上游miRNA調(diào)節(jié)因子Table 1 Predicted upstream miRNA regulators of PGC-1α

2.2 PGC-1α是miR-217的靶基因

通過Targetscan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-217與PGC-1α的3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)(圖1A)。因此，PGC-1α可能是miR-217的靶基因。雙熒光素酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，miR-217-mimics組的相對(duì)熒光素酶活性較對(duì)照組顯著下降(圖1B，P<0.05)，表明miR-217與PGC-1α基因的野生型3′UTR結(jié)合，可抑制下游的熒光素酶表達(dá)，而對(duì)突變型PGC-1α-3′UTR區(qū)的啟動(dòng)無(wú)影響。為進(jìn)一步確認(rèn)PGC-1α是miR-217的靶基因，利用miR-217-inhibitor抑制MCF-7細(xì)胞中內(nèi)源性miR-217表達(dá)，qRT-PCR分析顯示miR-217-inhibitor組比miR-IC組表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C，P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功。進(jìn)一步qRT-PCR檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染miR-217-inhibitor的MCF-7細(xì)胞PGC-1α mRNA表達(dá)水平明顯上升(圖1D，P<0.05)。Western blot分析也表明，miR-217-inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞PGC-1α的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖1E)。

A：miR-217與PGC-1α的可能結(jié)合位點(diǎn)；B：雙熒光素酶活性測(cè)定；C：qRT-PCR驗(yàn)證miR-217-inhibitor轉(zhuǎn)染效率；D：qRT-PCR檢測(cè)miR-217表達(dá)下調(diào)對(duì)PGC-1α基因表達(dá)的影響；E：Western blot檢測(cè)miR-217表達(dá)下調(diào)對(duì)PGC-1α蛋白表達(dá)的影響；*P<0.05圖1 PGC-1α是miR-217的靶基因Fig.1 miR-217 is the upstream regulator of PGC-1α

2.3 miR-217通過調(diào)控PGC-1α基因影響MCF-7細(xì)胞的增殖

已有研究證實(shí)下調(diào)miR-217抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖、導(dǎo)致了細(xì)胞周期的阻滯[11]。為進(jìn)一步證明miR-217通過調(diào)控PGC-1α基因表達(dá)發(fā)揮上述作用，通過siRNA(Si-PGC-1α)轉(zhuǎn)染下調(diào)PGC-1α表達(dá)并設(shè)置相應(yīng)對(duì)照(Si-C)。qRT-PCR顯示，PGC-1α的mRNA水平在Si-PGC-1α轉(zhuǎn)染后被顯著抑制(圖2A，P<0.05)。Western blot分析亦證實(shí)，PGC-1α蛋白表達(dá)被下調(diào)(圖2B)。MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在miR-217表達(dá)下調(diào)的乳腺癌細(xì)胞中，抑制PGC-1α能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(圖2C，P<0.05)。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在miR-217表達(dá)下調(diào)的乳腺癌細(xì)胞中，PGC-1α抑制也顯著促進(jìn)了細(xì)胞周期從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)變(圖2D)。

A：qRT-PCR驗(yàn)證siRNA轉(zhuǎn)染效率，*P<0.05；B：Western blot驗(yàn)證siRNA轉(zhuǎn)染效率；C：MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGC-1α表達(dá)抑制對(duì)細(xì)胞增殖的影響,與miR-217-inhibitor/Si-C組比較，*P<0.05；D：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PGC-1α表達(dá)抑制對(duì)細(xì)胞周期的影響圖2 miR-217通過調(diào)控PGC-1α基因影響MCF-7細(xì)胞的增殖Fig.2 Inhibition of PGC-1α reverses miR-217-downregulation induced suppression on MCF-7

2.4 miR-217對(duì)乳腺癌細(xì)胞PGC-1α的調(diào)節(jié)作用獨(dú)立于DACH1

有研究提示miR-217可通過靶向調(diào)控DACH1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖[11]。因此，我們進(jìn)一步探尋了PGC-1α和DACH1是否在miR-217表達(dá)下調(diào)的乳腺癌中具有功能性相互作用。在PGC-1α/DACH1 siRNA聯(lián)合轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞中進(jìn)行了5 d的MTT增殖試驗(yàn)。結(jié)果表明，下調(diào)PGC-1α表達(dá)后，即使抑制DACH1表達(dá)也能進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌的增殖(圖3A，P<0.05)。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在miR-217下調(diào)及PGC-1α抑制的乳腺癌細(xì)胞中，即使抑制DACH1表達(dá)也能促進(jìn)細(xì)胞周期從G0/G1期到S期的轉(zhuǎn)變(圖3B)。

上述研究表明PGC-1α和DACH1的信號(hào)通路在miR-217下調(diào)的乳腺癌細(xì)胞中是獨(dú)立的。

A：MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGC-1α及DACH1表達(dá)均抑制后對(duì)細(xì)胞增殖的影響，與miR-217-inhibitor/Si-PGC-1α/Si-C組比較，*P<0.05；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PGC-1α及DACH1表達(dá)均抑制后對(duì)細(xì)胞周期的影響圖3 miR-217對(duì)乳腺癌細(xì)胞PGC-1α的調(diào)節(jié)作用獨(dú)立于DACH1Fig.3 PGC-1α regulation in miR-217-dwonregulated breast cancer is independent of DACH1

3 討論

在人類乳腺癌中，雖然發(fā)現(xiàn)PGC-1α在癌組織中的表達(dá)與在正常乳腺上皮組織中的表達(dá)存在差異[6-7]，但未證實(shí)它對(duì)乳腺癌有直接調(diào)節(jié)作用[27]。本研究在人類乳腺癌中尋找與PGC-1α相關(guān)的miRNA上游調(diào)控因子。用TargetScan靶基因預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)了10個(gè)miRNA候選基因，基于miR-217與PGC-1α的結(jié)合Context++ 得分為90%，且miR-217有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展的作用[11]，我們推測(cè)miR-217可能是乳腺癌中PGC-1α的上游調(diào)節(jié)因子。

本研究結(jié)果證實(shí)了miR-217是人類乳腺癌PGC-1α上游調(diào)節(jié)因子的假設(shè)。首先，共轉(zhuǎn)染雙熒光素酶活性檢測(cè)表明，人miR-217確實(shí)與PGC-1α基因的3′UTR結(jié)合。其次，在下調(diào)miR-217表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞中，PGC-1α mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)。最重要的是，在miR-217表達(dá)下調(diào)的乳腺癌細(xì)胞中，抑制PGC-1α表達(dá)能顯著促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程，這是在乳腺癌體外研究中關(guān)于PGC-1α調(diào)控的一個(gè)新發(fā)現(xiàn)，此前未見有研究報(bào)道PGC-1α在乳腺癌調(diào)控中的直接作用。正如我們?cè)谶@項(xiàng)研究中所揭示的，PGC-1α的一般表達(dá)水平似乎對(duì)觸發(fā)乳腺癌的體外調(diào)節(jié)因素及生物學(xué)功能無(wú)效，然而，在miR-217下調(diào)誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，抑制PGC-1α表達(dá)可能具有致癌作用。

已有研究證明DACH1是miR-217的下游靶基因，其高表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-217誘導(dǎo)的乳腺癌進(jìn)展。因此，我們進(jìn)一步在miR-217表達(dá)下調(diào)的乳腺癌細(xì)胞中進(jìn)行了PGC-1α和DACH1靶向siRNA的雙重轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)下調(diào)PGC-1α表達(dá)后，即使抑制DACH1表達(dá)也能進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，提示PGC-1α和DACH1的調(diào)控信號(hào)通路是相互獨(dú)立的。本研究?jī)H在體外實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行探究，進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)室研究，包括對(duì)PGC-1α和DACH1下游信號(hào)通路的探索，必將有助于闡明乳腺癌中miRNA的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。