梅桂斌，陳 力，姜純杰，姚 平

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，武漢 430030

中國大陸患糖尿病人數(shù)高達(dá)1.3億，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1]。持續(xù)高血糖導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥和器官衰竭是造成2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者不良健康結(jié)局的主要原因。肝臟是重要的胰島素代謝器官，肥胖、代謝綜合征(MetS)與胰島素抵抗(IR)等典型的T2DM危險因素或病理生理學(xué)改變所致的代謝相關(guān)脂肪性肝病(metabolism-associated fatty liver disease，MAFLD)是常見的T2DM合并癥。研究表明，70%的T2DM患者同時患有MAFLD[2]，并且T2DM是肝纖維化等終末期肝病的關(guān)鍵預(yù)測因子[3]。同時，MAFLD也是T2DM進(jìn)展的驅(qū)動者，可加劇不良代謝[4]、血脂異常[5]和糖尿病心肌病[6]等并發(fā)癥。MAFLD在T2DM中的重要程度不言而明，然而目前對T2DM合并MAFLD的機(jī)制研究還很少，尚沒有靶向T2DM合并MAFLD的治療藥物。因此，尋找干預(yù)靶點，對T2DM合并MAFLD進(jìn)行有效防治具有重要意義。

日常飲食習(xí)慣的改變與膳食補充成為預(yù)防和治療疾病的良好選擇。富含于藍(lán)莓、芒果、蘋果、櫻桃等多種植物性食品的槲皮素(3，3，4，5，7-五羥黃酮，quercetin)，因具有良好生物活性而備受關(guān)注[7]。研究表明，槲皮素對糖尿病及多種模型的肝臟損傷有良好的保護(hù)作用。其可影響T2DM小鼠血糖水平[8]，顯著改善高糖處理肝細(xì)胞的線粒體功能[9]，抑制肝臟炎癥[10]。然而，目前有關(guān)槲皮素對T2DM合并MAFLD的作用和機(jī)制還不明確。

本研究通過高脂飼料(high fat diet，HFD)喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法構(gòu)建T2DM模型，探究槲皮素干預(yù)對小鼠肝臟脂質(zhì)沉積、組織形態(tài)、炎癥以及纖維化的影響，以期為T2DM肝損傷模型中槲皮素的保護(hù)效應(yīng)提供更多科學(xué)依據(jù)，進(jìn)一步為T2DM合并MAFLD提供防治策略。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

本研究使用的SPF級7～8周齡雄性C57BL/6J小鼠均被飼養(yǎng)于恒溫25 ℃、濕度為50%、黑暗/光循環(huán)為12 h間隔的環(huán)境中。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，40只小鼠隨機(jī)分為2組，每組20只。兩組小鼠分別喂飼HFD和正常飼料(10%脂肪)16周。在第17周，HFD組小鼠連續(xù)7 d腹腔注射小劑量STZ，建立T2DM模型，對照組小鼠則注射檸檬酸鹽緩沖液。1周后，測得空腹血糖濃度大于≥16.9 mmol/L的小鼠視為T2DM造模成功。隨后將正常飼養(yǎng)組小鼠分為正常對照組和槲皮素對照組，T2DM模型小鼠分為糖尿病組和糖尿病+槲皮素組，繼續(xù)喂養(yǎng)。正常對照組(Con)：正常飼料喂養(yǎng)；槲皮素對照組(Qu)：每kg正常飼料中混入1.5 g槲皮素(相當(dāng)于100 mg/kg體重)；糖尿病組(DM)：高脂喂養(yǎng)；糖尿病+槲皮素組(DM+Qu)：每kg高脂飼料中混入1.5 g槲皮素進(jìn)行干預(yù)。實驗期間觀察小鼠飲水、攝食并記錄進(jìn)食量，每周稱量2次體重。共喂養(yǎng)34周后處死，留取各組小鼠血清和肝臟樣本保存，用于后續(xù)實驗。基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平如表1所示。

表1 動物飼料配方(克)Table 1 Animal feeding stuff formula(g)

1.2 實驗材料

collagenⅠ抗體、α-SMA抗體購于英國Abcam公司。p65抗體購于美國CST公司。CTGF抗體購于美國Santa公司。ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、AST(谷草轉(zhuǎn)氨酶)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。TRIzol RNA提取試劑購于美國Thermo Fisher Scientific公司。PCR引物購于武漢擎科生物科技有限公司。Prime Script RT reagent kit、SYBR Premix Ex TaqTM購于日本TaKaRa公司。微量核酸濃度測定儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司。7900HT熒光實時定量PCR儀購于美國ABI公司。超聲檢測儀購于法國Supersonic Imagine公司。熒光倒置顯微鏡購于日本OLYMPUS公司。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 血清轉(zhuǎn)氨酶水平檢測 將37 ℃預(yù)溫的基質(zhì)液與血清待測樣本混勻，水浴30 min后加入苯肼，混勻后再次37 ℃水浴20 min，水浴結(jié)束后加入氫氧化鈉溶液，點板，酶標(biāo)儀于505 nm處讀取吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活性。

1.3.2 肝臟組織病理學(xué)染色 小鼠肝臟組織于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋，制成10 μm的切片備用。切片復(fù)水后，用蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)脫水封片，顯微鏡下成像分析，觀察細(xì)胞核染色、肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞排列等。上述切片在經(jīng)Masson染料染色后，觀察藍(lán)色膠原纖維數(shù)量。小鼠肝臟冰凍組織，OCT包埋后，利用冰凍切片機(jī)制成8 μm的切片，脂溶性染料油紅O對肝臟脂質(zhì)進(jìn)行染色，反映肝臟脂質(zhì)沉積。

1.3.3 組織病理學(xué)評分 為量化肝損傷，采取Kleiner(2005)的臨床研究網(wǎng)絡(luò)評分系統(tǒng)對非酒精脂肪性肝病活動度(NAFLD activity score，NAS)作半定量分析[11]，評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 臨床研究網(wǎng)絡(luò)評分系統(tǒng)Table 2 Clinical Research Network Score System

1.3.4 實時熒光定量PCR TRIzol試劑法提取肝臟組織RNA，使用紫外分光光度計測定RNA的濃度。去除基因組DNA后將RNA擴(kuò)增為cDNA。根據(jù)試劑盒說明書添加各PCR擴(kuò)增試劑及引物，最終形成10 μL反應(yīng)體系，DNA擴(kuò)增反應(yīng)在7900熒光定量PCR儀(7900HT)上進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)使用SDS 2.4.1處理，以GAPDH表達(dá)量作內(nèi)參對照，RNA相對表達(dá)量用2-ΔΔCt方法計算。引物基因序列如表3。

表3 引物基因序列Table 3 Primer gene sequences

1.3.5 超聲剪切波彈性成像 實驗結(jié)束前，將每組隨機(jī)選擇的小鼠送往華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院超聲科，使用超聲探測設(shè)備對麻醉后的小鼠肝臟進(jìn)行超聲剪切波彈性檢測后成像，依據(jù)測得的肝臟硬度值量化不同組小鼠肝纖維化水平。

1.3.6 免疫組化 石蠟切片在枸櫞酸鈉溶液中抗原修復(fù)，隨后用5%牛血清蛋白室溫封閉30 min，加入最適比例一抗，4 ℃孵育過夜。PBS清洗后，加入相應(yīng)二抗，孵育1 h，DAB辣根過氧化物酶顯色，封片，顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 槲皮素干預(yù)對血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響

結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，T2DM小鼠血清ALT水平增加了2.73倍(P<0.01)，AST增加了約2.18倍(P<0.01)，槲皮素干預(yù)顯著降低了ALT(P<0.01)、AST(P<0.05)水平，且槲皮素對照組與正常對照組相比無明顯變化，表明槲皮素對T2DM小鼠肝損傷具有保護(hù)作用。

A：血清ALT水平統(tǒng)計(n=3)；B：血清AST水平統(tǒng)計(n=3)；Con：正常對照組；DM：糖尿病組；Qu，槲皮素對照組；DM+Qu：糖尿病+槲皮素組；與正常對照組比較，**P<0.01；與糖尿病組比較，#P<0.05，##P<0.01 圖1 槲皮素干預(yù)對血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響Fig.1 Effect of quercetin on serum transaminase level

2.2 槲皮素干預(yù)對肝臟組織病理學(xué)的影響

油紅O染色與蘇木精-伊紅染色被用于描述小鼠肝臟脂質(zhì)沉積與組織形態(tài)。如圖2A所示，相比于正常飼料喂養(yǎng)或槲皮素單獨喂養(yǎng)的小鼠，T2DM小鼠油紅O染色切片視野內(nèi)可見大片紅色，表明有較為嚴(yán)重的脂質(zhì)沉積，而經(jīng)槲皮素干預(yù)后，小鼠肝臟脂滴數(shù)量顯著減少。同時，蘇木精-伊紅染色結(jié)果(圖2B)顯示，T2DM小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉與肝細(xì)胞排列均不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)疏松；細(xì)胞核大小不一且呈聚集狀，視野內(nèi)有大量空泡化細(xì)胞，多見脂肪樣變性。而槲皮素干預(yù)組小鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)較為整齊的排列，空泡細(xì)胞與脂肪樣變性情況明顯改善，未見明顯炎性浸潤(黑色箭頭)。NAS評分用于量化蘇木精-伊紅染色結(jié)果，如圖2B所示，T2DM組NAS評分為正常飼料喂養(yǎng)組的4.43倍(P<0.01)，經(jīng)槲皮素干預(yù)后，NAS評分顯著下降(P<0.05)。

A：各組肝臟組織代表性油紅O染色圖片(×200)；B：各組肝臟組織代表性蘇木精-伊紅染色圖片(×400)；C：NAS評分統(tǒng)計(n=3)；Con：正常對照組；DM：糖尿病組；Qu，槲皮素對照組；DM+Qu：糖尿病+槲皮素組；與正常對照組比較，**P<0.001；與糖尿病組比較，##P<0.01圖2 槲皮素干預(yù)對肝臟組織病理學(xué)的影響Fig.2 Effect of quercetin on liver histopathology

2.3 槲皮素干預(yù)對肝臟炎癥的影響

使用實時熒光定量PCR的方法檢測肝臟組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的mRNA水平，以評估小鼠肝臟炎性損傷情況，初步探尋槲皮素的肝臟保護(hù)機(jī)制。如圖3A～3D所示，與對照組相比，T2DM小鼠炎性因子mRNA水平均顯著提升(均P<0.05)，槲皮素干預(yù)可顯著抑制炎性因子表達(dá)的異常增加(均P<0.05)。NF-κB是炎癥進(jìn)展的重要核轉(zhuǎn)錄因子，p65是NF-κB發(fā)揮轉(zhuǎn)錄起始作用的關(guān)鍵組成成分，免疫組化結(jié)果顯示(圖3E)，T2DM小鼠肝臟p65表達(dá)水平顯著上升，槲皮素處理則能有效降低p65表達(dá)(P<0.01)。以上結(jié)果提示，槲皮素能夠有效拮抗炎癥，其抗炎作用可能與NF-κB表達(dá)抑制有關(guān)。

A～D：各組肝臟炎性因子mRNA水平統(tǒng)計(n=3)；E：免疫組織化學(xué)法檢測NF-κB p65的代表性圖片(×400)及定量統(tǒng)計(n=3)；Con：正常對照組；DM：糖尿病組；Qu，槲皮素對照組；DM+Qu：糖尿病+槲皮素組；與正常對照組比較，*P<0.05 **P<0.01；與糖尿病組比較，#P<0.05##P<0.01圖3 槲皮素干預(yù)對肝臟炎癥的影響Fig.3 Effect of quercetin on liver inflammation

2.4 槲皮素干預(yù)對肝臟組織纖維化的影響

通過Masson染色、超聲剪切波彈性成像和免疫組化確定T2DM小鼠肝臟纖維化損傷水平。如圖4A所示，與對照組相比，T2DM小鼠肝組織出現(xiàn)顯著的纖維化病變，顯示為增加的藍(lán)色膠原纖維數(shù)量，而槲皮素處理組纖維化情況明顯減輕。與此一致，超聲剪切波彈性成像(圖4B)結(jié)果顯示，T2DM小鼠肝臟硬度相對于對照組顯著上升(P<0.01)，槲皮素有效逆轉(zhuǎn)了肝臟硬度的異常增加(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，T2DM小鼠肝臟的結(jié)締組織生長因子(CTGF)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)以及Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ)的陽性表達(dá)顯著增加，而槲皮素干預(yù)減少了纖維化因子CTGF、α-SMA和collagen Ⅰ陽性表達(dá)(圖4C～4E)。以上結(jié)果表明槲皮素對T2DM小鼠肝臟纖維化損傷有較好的抑制作用。

A：各組肝臟組織代表性Masson染色圖片(×400)；B：各組肝臟組織代表性超聲剪切波彈性成像圖片及硬度值統(tǒng)計(n=3)；C～E：免疫組織化學(xué)法檢測纖維化因子CTGF(C)、α-SMA(D)和collagen Ⅰ(E)的代表性圖片(×400)；Con：正常對照組;DM：糖尿病組;Qu，槲皮素對照組;DM+Qu：糖尿病+槲皮素組；與正常對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05 圖4 槲皮素對糖尿病小鼠肝臟纖維化的影響Fig.4 Effect of quercetin on liver fibrosis in diabetic mice

3 討論

本研究通過HFD誘導(dǎo)胰島素抵抗，并連續(xù)注射STZ致使β細(xì)胞死亡，建立T2DM模型。此模型高度模擬了疾病事件從胰島素抵抗到β細(xì)胞功能障礙的自然史，能夠有效重現(xiàn)人類T2DM主要臨床和分子表型[12]。在此模型下用槲皮素進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，槲皮素有效改善T2DM小鼠肝臟受損和纖維化病變，其機(jī)制可能歸因于其抗炎功效。我們的研究為T2DM合并MAFLD的膳食預(yù)防療法提供了新的思路。

炎癥是T2DM合并MAFLD病癥進(jìn)展的重要拐點。T2DM患者糖脂代謝紊亂導(dǎo)致的脂毒性物質(zhì)過度累積以及氧化應(yīng)激均誘發(fā)炎癥，引發(fā)炎癥關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB異常激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α和IL-6等表達(dá)增加[13]。在銅鋅超氧化物歧化酶缺乏的氧化應(yīng)激模型中，Mohammed等[14]發(fā)現(xiàn)肝臟巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80以及炎性因子IL-1β表達(dá)增加，伴隨肝纖維化進(jìn)展。而在高度激活NLRP3炎性小體的小鼠模型中，其下游IL-1β表達(dá)增加將加劇肝纖維化[15]，在蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(MCD)喂養(yǎng)的db/db糖尿病小鼠中，通過給藥或敲除炎癥相關(guān)基因的方式抑制炎癥，則有效減緩了肝纖維化進(jìn)展[16]。因此，炎癥可能是促進(jìn)T2DM肝臟損傷向不可逆轉(zhuǎn)的纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制，抑制炎癥過度激活，將有助于減緩T2DM合并MAFLD向肝纖維化等終末期肝臟疾病進(jìn)展。本研究中，我們觀察到T2DM小鼠肝臟炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)的異常激活，伴隨肝臟膠原沉積，纖維化因子CTGF、α-SMA以及collagenⅠ表達(dá)增加，肝臟硬度增加。我們的結(jié)果為揭示T2DM模型下肝損傷的干預(yù)靶點提供了科學(xué)依據(jù)。

長期以來，槲皮素由于其良好的抗炎作用備受關(guān)注。在酒精肝模型中，通過靶向HO-1，槲皮素抑制ROS/NF-κB/NLRP3炎性小體信號通路過度激活，減輕肝損傷[17]。我們的研究結(jié)果與之一致，在T2DM模型中，我們觀察到了槲皮素對肝臟炎癥的良好拮抗效應(yīng)，其可能與NF-κB的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)，未來的研究將深入探討其作用機(jī)制，以期為防治高糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷提供新的方向。