李琳 李建東 高志康 徐浩 崔艷峰

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是人類最具侵襲性的高度惡性腫瘤,因?yàn)樗那忠u、轉(zhuǎn)移能力,被列為癌癥相關(guān)死亡的最常見(jiàn)原因之一［1,2］。伴隨免疫學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展,肝癌在免疫治療方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,但高復(fù)發(fā)率仍然是延長(zhǎng)生存期的一個(gè)主要障礙。HCC 是一種與慢性炎癥相關(guān)的腫瘤。在肝細(xì)胞癌的炎癥微環(huán)境中,入侵的炎癥細(xì)胞主要是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)［3］。研究表明,巨噬細(xì)胞的去除可以抑制腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［4-6］。在腫瘤微環(huán)境下,研究巨噬細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制［7］,將為治療HCC 提供新的策略。為此,本研究通過(guò)分化巨噬細(xì)胞作用肝癌SMCC-7721 細(xì)胞,探究相關(guān)巨噬細(xì)胞與SMCC-7721 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的生物學(xué)關(guān)系,為揭示HCC 的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人單核巨噬細(xì)胞(THP-1)獲自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。人肝癌細(xì)胞SMCC-7721 細(xì)胞為本室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)單核巨噬細(xì)胞 THP-1 在RPMI-1640 培養(yǎng)基(Sangon Biotech)中培養(yǎng),該培養(yǎng)基含10%胎牛血清(FBS,Sangon Biotech)和1%青霉素/鏈霉素。細(xì)胞在37℃和5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 巨噬細(xì)胞的極化 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的THP-1,按2×104/孔接種于24 孔板共培小室上室中。50 mg/ml 的MCSF 作用24 h 后誘導(dǎo)THP-1分化為M0 巨噬細(xì)胞；100 ng/ml 脂多糖(LPS)和γ-干擾素(IFN-γ)處理24 h,誘導(dǎo)THP-1 向M1 型巨噬細(xì)胞分化。THP-1 與IL-4(20 mg/ml)共孵育24 h 分化為M2 型巨噬細(xì)胞。THP-1 在含50% HepG2 細(xì)胞上清液和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d,誘導(dǎo)分化為TAMs。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) SMCC-7721 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基,37℃和5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.4 免疫印跡 使用組總蛋白提取試劑盒(Sangon Biotech)從細(xì)胞中提取總蛋白。通過(guò)蛋白質(zhì)電泳分離不同樣品中的等效蛋白,然后轉(zhuǎn)化到硝酸纖維素膜(NC)上。用一抗于4℃孵育過(guò)夜,浸泡于封閉緩沖液中。用TBST 洗膜數(shù)次后,用標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶的二抗與膜共孵育。用ImageJ 軟件檢測(cè)蛋白條帶的灰度值。

1.2.5 MTT 分析 SMCC-7721 細(xì)胞與1.2.2 極化的巨噬細(xì)胞的上清孵育。隨后,將SMCC-7721 細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞密度至10 ml。將細(xì)胞懸浮液接種于96 孔板中,每孔懸浮液100 μl,培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml),37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。然后,去除細(xì)胞上清,加入DMSO(100 μl)混勻于每孔中。采用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)樣品的吸光度。

1.2.6 Transwell 分析 SMCC-7721 細(xì)胞與1.2.2 極化的巨噬細(xì)胞上清孵育24 h。隨后,使用孔徑為8 μm 的聚碳酸酯膜(Corning)24 孔Boyden 室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用無(wú)血清培養(yǎng)基將基質(zhì)稀釋至1 mg/ml,蓋于Boyden chambers上腔室。然后將SMCC-7721 細(xì)胞懸液(5×104)接種到上室；下腔中加入含10%胎牛血清的600 μl 新鮮培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h 后,取出小室,4%多聚甲醛固定30 min,0.5%結(jié)晶紫染色20 min。用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)的未遷移的細(xì)胞擦干凈,晾干,在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)除Transwell 小室不包被基質(zhì)膠外,其余操作同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四種巨噬細(xì)胞對(duì)SMCC-7721 細(xì)胞增殖能力的影響 四種巨噬細(xì)胞上清液與SMCC-7721 細(xì)胞共培養(yǎng)12 h、24 h 進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示,相較于M0組,M1 組的SMCC-7721 細(xì)胞減少,M2 和TAMs 組的SMCC-7721 細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,M1 巨噬細(xì)胞抑制SMCC-7721 細(xì)胞增殖,M2 巨噬細(xì)胞和TAMs 促進(jìn)SMCC-7721 細(xì)胞增殖。

圖1 四種巨噬細(xì)胞對(duì)SMCC-7721 細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 四種巨噬細(xì)胞上清液對(duì)SMCC-7721 細(xì)胞遷移能力的影響 四種巨噬細(xì)胞上清液與SMCC-7721 細(xì)胞共培養(yǎng)后進(jìn)行Transwell 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2(A)所示,相較于M0 組,M1 組的SMCC-7721 細(xì)胞遷移能力減弱,M2 和TAMs 組的SMCC-7721 細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,M1 巨噬細(xì)胞可抑制SMCC-7721 細(xì)胞遷移能力,M2 巨噬細(xì)胞和TAMs 促進(jìn)SMCC-7721 細(xì)胞遷移能力。

圖2 四種巨噬細(xì)胞對(duì)SMCC-7721 細(xì)胞遷移能力的影響

2.3 四種巨噬細(xì)胞上清液對(duì)SMCC-7721 細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(A)所示,相較于M0 組,M1 組的SMCC-7721 細(xì)胞侵襲能力減弱,M2 和TAMs 組的SMCC-7721 細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此表明,M1 巨噬細(xì)胞可抑制SMCC-7721 細(xì)胞侵襲能力,M2 巨噬細(xì)胞和TAMs促進(jìn)SMCC-7721 細(xì)胞侵襲能力。

圖3 四種巨噬細(xì)胞對(duì)SMCC-7721 細(xì)胞侵襲能力的影響

2.4 Western blot 檢測(cè)四種巨噬細(xì)胞上清液對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT 標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示,與M0 組相比,M1 組的E-cadherin 表達(dá)升高,N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)下降；M2 和TAMs 組的E-cadherin 表達(dá)下降,N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)升高。這說(shuō)明M1 巨噬細(xì)胞抑制SMCC-7721 細(xì)胞發(fā)生EMT,M2 巨噬細(xì)胞和TAMs 能夠誘導(dǎo)SMCC-7721 細(xì)胞發(fā)生EMT。見(jiàn)圖4。

圖4 Western blot 檢測(cè)四種巨噬細(xì)胞與SMCC-7721 細(xì)胞對(duì)EMT 標(biāo)記蛋白E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)

4 討論

肝癌是全球第五大常見(jiàn)癌癥,是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大惡性腫瘤［8］。盡管近年來(lái)肝癌的診斷和治療均取得極大進(jìn)展,但肝癌患者的預(yù)后仍然很差。肝內(nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肝癌治療的主要挑戰(zhàn),也是導(dǎo)致肝癌患者的預(yù)后不良主要原因［9,10］。因此,尋找新的治療肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方案是至關(guān)重要的。

HCC 是一種與慢性炎癥相關(guān)的腫瘤。在肝細(xì)胞癌的炎癥微環(huán)境中,入侵的炎癥細(xì)胞主要是TAMs。免疫學(xué)研究表明,巨噬細(xì)胞有兩種表型：M1 和M2。在腫瘤微環(huán)境中,巨噬菌體可以通過(guò)各種細(xì)胞因子(如IL-4 和IL-10)的刺激極化成M2 巨噬細(xì)胞。M1 巨噬細(xì)胞具有病原體清除和抗腫瘤活性的特點(diǎn)。相比之下,M2 巨噬細(xì)胞的主要功能是免疫抑制和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、新生血管和組織基質(zhì)重構(gòu)［11］。此外,TAMs 通過(guò)釋放生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶在HCC 的各個(gè)階段發(fā)揮著重要作用［12］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,巨噬細(xì)胞的去除可以抑制腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。在我們的前期研究發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素M1 巨噬細(xì)胞中高度表達(dá),白介素-10(IL-10)的表達(dá)和白介素-13(IL-13)在M2 巨噬細(xì)胞明顯上調(diào)。M0 巨噬細(xì)胞為非極化巨噬細(xì)胞,各種細(xì)胞因子的表達(dá)不會(huì)像極化巨噬細(xì)胞那樣有明顯的偏置。M1 型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,如白介素-12(IL-12)和TNF-α。M1 巨噬細(xì)胞IL-10 表達(dá)降低,表現(xiàn)出明顯的促炎活性［13］。然而,M2 巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-10,而IL-12 下調(diào),賦予了強(qiáng)大的抗炎特性［14］。因此,與M0 巨噬細(xì)胞相比,M2巨噬細(xì)胞和TAMs 中IL-12 和TNF-α 的表達(dá)降低［15］,TAMs 表現(xiàn)出M2 樣表型。

本研究發(fā)現(xiàn),M1 巨噬細(xì)胞對(duì)SMCC-7721 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有明顯的抑制作用,而M2 巨噬細(xì)胞和TAMs 對(duì)SMCC-7721 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有明顯的促進(jìn)作用。M2 巨噬細(xì)胞和TAMs 能夠誘導(dǎo)SMCC-7721 細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白標(biāo)志物改變,E-cadherin 表達(dá)下降,N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)升高。這些結(jié)果提示我們,巨噬細(xì)胞通過(guò)極化為M1 巨噬細(xì)胞抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲；M2 巨噬細(xì)胞和TAMs 促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT 樣改變,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的改變。有研究發(fā)現(xiàn),隨著肝癌進(jìn)展,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞參與腫瘤微環(huán)境的建立并促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［16］,導(dǎo)致宿主細(xì)胞免疫紊亂及免疫沉默,刺激腫瘤生長(zhǎng)因子生成,誘導(dǎo)炎性反應(yīng)［17］。由此我們推測(cè),在肝癌疾病的發(fā)展過(guò)程中,M2 巨噬細(xì)胞和TAMs 的促腫瘤效應(yīng)超出M1 巨噬細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng),造成機(jī)體免疫系統(tǒng)的紊亂,促進(jìn)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。

肝癌是發(fā)病進(jìn)程多步驟、分階段的疾病,EMT 是反映細(xì)胞侵襲、遷移能力的重要指標(biāo),抑制EMT 可減弱肝癌的轉(zhuǎn)移,從而提高肝癌的臨床治療效果,降低肝癌復(fù)發(fā)率［18］。在肝癌細(xì)胞SMCC-7721 中,腫瘤巨噬細(xì)胞可以通過(guò)EMT 過(guò)程影響細(xì)胞侵襲,但在其他肝癌細(xì)胞系中是否有相同的意義,仍需我們進(jìn)一步探究。