宋莉紅，丁 超，陳 研，卜春亞

(北京農(nóng)學(xué)院 生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)為世界性主要害螨之一，又名紅蜘蛛，俗稱“紅蛐”[1]。朱砂葉螨屬于植食性螨類，幾乎危害所有的闊葉植物，分布廣泛且主要分布在溫暖地區(qū)[1]。該害螨主要附著在寄主植物葉片的背面吸食汁液，其種群世代周期短，繁殖較快，為害周期長(zhǎng)，有性生殖與孤雌生殖同時(shí)存在[2]。朱砂葉螨繁殖快和分布廣泛等，對(duì)多種經(jīng)濟(jì)作物造成了嚴(yán)重的損失，引起了經(jīng)濟(jì)學(xué)家和作物學(xué)家以及各界學(xué)者的密切關(guān)注[3]。

目前人們對(duì)于朱砂葉螨的防治主要以化學(xué)防治為主，常用有炔螨特、氟蟲脲、噠螨靈、阿維菌素等殺螨劑[4]。但是引起的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和農(nóng)藥降解等一系列環(huán)境問題也越來越嚴(yán)重，而且長(zhǎng)期使用導(dǎo)致朱砂葉螨產(chǎn)生了一系列的抗藥性[5]。

幾丁質(zhì)脫乙?；?CDA)廣泛存在于昆蟲、細(xì)菌和真菌中，且不存在于哺乳動(dòng)物和高等植物中[6]。幾丁質(zhì)脫乙?；甘怯绊懤ハx表皮發(fā)育的關(guān)鍵酶，是昆蟲體內(nèi)常見的代謝酶類，涉及昆蟲的蛻皮、發(fā)育、免疫等多方面的功能[7]。其主要作用是將幾丁質(zhì)去乙酰化降解為殼聚糖，維持昆蟲體內(nèi)的幾丁質(zhì)代謝平衡[8]。

1984年，首次在魯氏毛霉(Mucorroxianus)的提取物中發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)脫乙?；福撕髮?duì)幾丁質(zhì)脫乙?；傅难芯吭絹碓缴钊隱9]。隨著幾丁質(zhì)脫乙酰酶研究的深入，發(fā)現(xiàn)昆蟲CDA種類眾多且廣泛分布于各個(gè)器官中[10,11]。CDAs分為五個(gè)家族(GroupⅠ-GroupⅤ)，每個(gè)家族的結(jié)構(gòu)與組成，組織特異性和功能特異性都存在較大差異。GroupⅠ、GroupⅡ的CDAs會(huì)影響昆蟲蛻皮的發(fā)展，在沒有CDA的情況下會(huì)導(dǎo)致昆蟲氣管，翅鞘和關(guān)節(jié)的異常發(fā)育。 目前對(duì)GroupⅢ和GroupⅣ的CDAs的組織定位尚不十分明確，GroupⅤ的CDAs在中腸中的表達(dá)較多[7]。

幾丁質(zhì)脫乙?；冈诤︱陌l(fā)育過程中扮演了重要角色，可作為生物防治的潛在靶標(biāo)基因[12]。就此本研究克隆朱砂葉螨CDA5a、CDA5b、CDA5c基因且分析其表達(dá)特征，為闡明朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙酰基酶家族的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

由北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的敏感系朱砂葉螨、EasyPure? RNA Kit、TransScript? One-Step gDNA Removal 和cDNA Synthesis SuperMix均購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司；X5 High-Fidelity DNA Polymerase PCR Mix、M5 HiPer pTOPO-Blunt CloningKit、M5 HiPer Top10 Competent Cell購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、FastPure Plasmid Mini Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)購(gòu)自大連寶生物(Takara)公司。

1.2 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA5s基因的克隆

將10 mg朱砂葉螨放至1.5 mL離心管內(nèi)，將其迅速放于液氮中約30 s，用電動(dòng)研磨器充分研磨組織，參照EasyPure? RNA Kit說明書提取朱砂葉螨總RNA，對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

根據(jù)前期獲得的朱砂葉螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在NCBI在線網(wǎng)址上找到高同源性物種二斑葉螨，參照其幾丁質(zhì)脫乙?；富?，用Beacon Designer 7設(shè)計(jì)5′和3′引物進(jìn)行同源克隆，由于TecCDA5b是TecCDA5a的剪切子，與TecCDA5a只差約100 bp，很難區(qū)分TecCDA5b和TecCDA5a，故TecCDA5b分段進(jìn)行擴(kuò)增，其引物序列參照表1。

表1 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；傅幕驍U(kuò)增引物Tab.1 Amplificationprimer of Tetranychus cinnabarinus chitinase genes

以朱砂葉螨cDNA為模板進(jìn)行幾丁質(zhì)脫乙?；傅臄U(kuò)增(50 μL)，體系配置參照X5 High-Fidelity DNA Polymerase PCR Mix說明書。使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。后使純化產(chǎn)物連接至TOPO載體上，72 ℃熱激轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞中，后提取其質(zhì)粒送交上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙酰基酶TecCDA5a、TecCDA5b、TecCDA5c基因特征分析

對(duì)基因序列進(jìn)行開放閱讀框的推導(dǎo)；將朱砂葉螨CDAs的CDS區(qū)域翻譯成氨基酸序列后，將其氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)；使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的；使用Bootstrap=200的方法對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算；通過SMART在線網(wǎng)址和ProtScale進(jìn)行蛋白功能域的預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)疏水區(qū)的分析。

1.4 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA5s在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

1.4.1 提取朱砂葉螨不同發(fā)育時(shí)期的RNA及第一鏈cDNA合成 用細(xì)毛筆挑取約2 000頭生長(zhǎng)狀況良好的朱砂葉螨雌成螨至一盆新鮮白蕓豆葉片上，讓其進(jìn)行24 h的產(chǎn)卵，在體式顯微鏡觀察到大量的卵后將葉片上的雌成螨全部挑下。4 d左右朱砂葉螨由卵發(fā)育為幼螨，約6 d后發(fā)育為若螨，9～10 d后發(fā)育為成螨。將同一時(shí)間段的朱砂葉螨用細(xì)毛筆挑至0.02% 的吐溫20溶液中進(jìn)行分離，使用不同目的篩子分別篩選出幼螨、若螨、成螨。過篩后清洗并晾干朱砂葉螨表面的水溶液，待螨可以活動(dòng)后用細(xì)毛筆分別收集4個(gè)時(shí)期的螨至2 mL離心管中。使用EasyPure ? RNA Kit試劑提取各個(gè)時(shí)期的朱砂葉螨的RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)朱砂葉螨CDAs序列，設(shè)計(jì)TecCDA5s基因和內(nèi)參基因β-actin 的引物，設(shè)計(jì)好的引物通過 ORCAE 在線軟件剔除可能產(chǎn)生干擾的引物，并對(duì)設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，選擇跑膠條帶較好的引物進(jìn)行 RT-qPCR。引物見表 2。

表2 TecCDA5s熒光定量引物Tab.2 RT-qPCR primers of TecCDA5s

以得到的朱砂葉螨 4 個(gè)時(shí)期的 cDNA 為模板,熒光定量體系配置及程序參照TAKARA公司的TB Green ? Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)說明書。預(yù)變性：95 ℃，30 s；變性;95 ℃,5 s; 退火延伸：60 ℃,30 s; 40 個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)中每個(gè)樣本設(shè)置 3 次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置2個(gè)陰性對(duì)照。使用△△Ct 法的程序，運(yùn)用 2-△△Ct法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量，以Egg (卵)時(shí)期為參照，其相對(duì)表達(dá)量為1，采用單因素方差分析(ANOVA)和 Tukey's HSD 算法進(jìn)行分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA5基因的克隆

對(duì)朱砂葉螨的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到TecCDA5s的完整序列，根據(jù)其完整序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增得到了符合預(yù)期大小的TecCDA5a、TecCDA5b和TecCDA5c，基因如下圖1所示。由于TecCDA5b是TecCDA5a的剪切子，與TecCDA5a只差約100 bp，很難區(qū)分TecCDA5b和TecCDA5a，故TecCDA5b分三段進(jìn)行擴(kuò)增。

TecCDA5a、TecCDA5b、TecCDA5c全長(zhǎng)分別為4 003 bp、3 901 bp、4 072 bp。其中TecCDA5a包含一個(gè)長(zhǎng)度為3 915 bp的開放閱讀框，共編碼1 304個(gè)氨基酸，以5′端第40位開始的ATG為起始密碼子開始編碼蛋白，以TAA為終止密碼子，蛋白質(zhì)分子量為142 925道爾頓。TecCDA5b包含一個(gè)長(zhǎng)度為3 813 bp的開放閱讀框，共編碼1 270個(gè)氨基酸，以5′端第40位開始的ATG為起始密碼子開始編碼蛋白，以TAA為終止密碼子，蛋白質(zhì)分子量為139 478道爾頓。TecCDA5c包含一個(gè)長(zhǎng)度為4 059bp的開放閱讀框，共編碼1 352個(gè)氨基酸，以5′端第12位開始的ATG為起始密碼子開始編碼蛋白，以TGA為終止密碼子，蛋白質(zhì)分子量為150 390道爾頓。將克隆得到的基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)得到登錄號(hào)分別為：MK813905、MN852245、MK813906。

2.2 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA5s氨基酸序列同源比對(duì)分析

將翻譯得到的TecCDA5s氨基酸在NCBI上使用Blast工具進(jìn)行篩選，得到多組同源性高的其他物種的氨基酸序列，將得到的朱砂葉螨、二斑葉螨、赤擬谷盜的氨基酸序列軟件進(jìn)行同源比對(duì)分析。分析結(jié)果如圖2所示，可以看出朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙酰基酶與二斑葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；傅陌被嵝蛄杏兄叨鹊耐葱?，朱砂葉螨TecCDA5a、TecCDA5b和TecCDA5c與二斑葉螨的同源性分別為98.86%、98.83%和98.97%，主要是結(jié)構(gòu)域部分的氨基酸序列高度保守。

2.3 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；傅鞍捉Y(jié)構(gòu)域分析預(yù)測(cè)

通過SMART和NCBI在線工具CDD對(duì)朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；傅陌被嵝蛄羞M(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，得到圖3。分析結(jié)果表明TecCDA5a、TecCDA5b和TecCDA5c具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ChBD)和多糖多乙?；呋Y(jié)構(gòu)域(Polysaccharide deacetylase)，不具有低密度脂蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LDLa)。TecCDA5a、TecCDA5b在氨基酸N端第63位到117位均為幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，都包含約55個(gè)氨基酸；TecCDA5a的977～1 110位、TecCDA5b的 943～1 076位為多糖多乙?；呋Y(jié)構(gòu)域，都包含約134個(gè)氨基酸，二者低復(fù)雜區(qū)域都為9個(gè)。TecCDA5c在氨基酸N端的100～154位為幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，共包含約55個(gè)氨基酸； 1 022～1 155位為多糖多乙酰基催化結(jié)構(gòu)域，包含約134個(gè)氨基酸；而其低復(fù)雜區(qū)域較多，為11個(gè)。

2.4 分子進(jìn)化樹構(gòu)建

將朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙酰基酶氨基酸序列通過與NCBI上查找到的其他物種的幾丁質(zhì)脫乙?；赴被徇M(jìn)行同源性比較。從圖4可以看出，蜱螨目的二斑葉螨與TecCDA5c親緣關(guān)系最近，因此朱砂葉螨三個(gè)序列分別命名為TecCDA5a、TecCDA5b和TecCDA5c，且都屬于幾丁質(zhì)脫乙?；富蚣易逯械腉roup Ⅳ。與赤擬谷盜、黑腹果蠅等相對(duì)遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.5 TecCDA5基因在朱砂葉螨不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律

將得到的數(shù)據(jù)通過2-△△Ct法計(jì)算朱砂葉螨不同發(fā)育時(shí)期相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果用Origin軟件進(jìn)行作圖，結(jié)果如圖5所示。

通過上圖分析可知朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；冈诼?、幼螨、若螨、成螨期的mRNA的豐度都有所不同。TecCDA5b作為TecCDA5a的剪切子，兩者只相差102 bp，難以找到合適的RT-qPCR引物,TecCDA5a+b的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果表明TecCDA5s在朱砂葉螨生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，但是表達(dá)量之間具有顯著性差異，說明其具有表達(dá)特異性。TecCDA5a+b和TecCDA5c都是在成螨時(shí)期表達(dá)量最高，在幼螨中的表達(dá)量最低，但是在卵中的表達(dá)量都要低于若螨；TecCDA5s的表達(dá)均呈現(xiàn)先下跌后升的趨勢(shì)。

3 討 論

幾丁質(zhì)脫乙?；附陙聿砰_始被人們關(guān)注，其在昆蟲體內(nèi)均參與幾丁質(zhì)代謝[13]。由于幾丁質(zhì)脫乙?；讣易鍞?shù)量多，且未被發(fā)現(xiàn)的基因較多，無法完全弄清其相應(yīng)的功能。目前研究最多的CDA1和CDA2與昆蟲的表皮形成有關(guān)，且都屬于GroupⅠ，對(duì)于其他家族的CDA了解還不夠深入[14]。

CDA5s屬于親水性蛋白，分析其蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列中只含有ChBD和多糖多乙?；呋Y(jié)構(gòu)域，沒有LDLa，且都含有信號(hào)肽，可以引導(dǎo)蛋白質(zhì)到達(dá)細(xì)胞含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)，使蛋白質(zhì)得到充分加工。通過構(gòu)建分子發(fā)育樹和同源比對(duì)分析，把TecCDA5s歸于Group Ⅳ。

目前研究表明赤擬谷盜TcCDA5a和TcCDA5b均主要在胴體中表達(dá)，TcCDA5a在胴體中特異性表達(dá)，而TcCDA5b在幼蟲的中腸中特異性表達(dá)[15]。肩突硬蜱等昆蟲的CDA5基因?qū)ζ渫懫o明顯影響，但在個(gè)別昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)其對(duì)圍食膜可能有一定的影響[16]。稻縱卷葉螟的CmCDA5則在表皮中表達(dá)量最高，可能參與其蛻皮，不同昆蟲的同一種CDA基因功能也存在著些許差異。

本試驗(yàn)通過對(duì)TecCDA5s的時(shí)間表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了其在朱砂葉螨不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律?？傮w來說其表達(dá)量有著相似性，但是又存在著些許的差異，這可能與其在分子層面上的差異有關(guān)。TecCDA5s均不含LDLa功能域，哺乳動(dòng)物中含有多個(gè)低密度脂蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域他們負(fù)責(zé)結(jié)合并且轉(zhuǎn)運(yùn)脂蛋白進(jìn)入細(xì)胞中，從而參與膽固醇代謝[14]。而昆蟲體內(nèi)低密度脂蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可能參與脂蛋白的運(yùn)輸，而脂蛋白同時(shí)又是表皮的重要組成成分，缺少這一結(jié)構(gòu)域可能導(dǎo)致其不能參與脂蛋白的運(yùn)輸過程，因而不影響昆蟲的表皮形成過程。且TecCDA5s控制蛻皮有關(guān)的TecCDA1和TecCDA2之間的表達(dá)量存在著顯著的差異，TecCDA1和TecCDA2均在卵時(shí)期的表達(dá)量最高或較高，而TecCDA5s在卵時(shí)期相對(duì)表達(dá)量較低，這說明了其功能上的差異及特異性，TecCDA5s在朱砂葉螨蛻皮過程中是否發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步探究。本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；富蚣易宓难芯繑U(kuò)充了相關(guān)數(shù)據(jù)，為基于靶向殺蟲基因的篩選深入研究打下基礎(chǔ)。