牟春地，燕偉平，余 剛，秦新月 ，馮金洲△

(1.重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 401420;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 400016;3.山東省廣饒縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東東營 257300)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，特征性病理改變包括白質(zhì)脫髓鞘、炎性細(xì)胞浸潤、軸突破壞等。MS病程反復(fù)發(fā)作，是30歲以下年輕人最常見的致殘性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，常導(dǎo)致永久性軀體功能殘疾[1]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型是研究MS炎性反應(yīng)與免疫等病理生理過程常用的經(jīng)典動物模型。

最近研究表明排斥性導(dǎo)向分子a(repulsive guidance molecule a，RGMa)在MS的病理過程具有重要作用。采用RGMa特異性抗體抑制RGMa的表達(dá)能夠促進(jìn)小鼠的軸突和髓鞘再生，減少小膠質(zhì)細(xì)胞激活面積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[2-3]，但具體作用機(jī)制仍未完全明確。白細(xì)胞介素-27(IL-27)是近年來新發(fā)現(xiàn)的IL-12家族成員，在自身免疫疾病和宿主抗感染過程中起重要作用[4]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)IL-27表達(dá)在EAE小鼠顯著升高，而且抑制IL-27的表達(dá)能夠顯著緩解EAE小鼠的神經(jīng)功能損傷程度[5]。本研究旨在通過EAE小鼠模型，利用特異性RNA干擾分子抑制RGMa的表達(dá)，探討RGMa對EAE小鼠神經(jīng)功能的影響及通過Rho激酶調(diào)控IL-27的相關(guān)分子機(jī)制，為MS的臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物

雌性C57BL/6小鼠(8～10周)購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心空氣層流飼養(yǎng)室(不限食物與水的攝入)。所有小鼠在相同環(huán)境下喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～28 ℃，相對濕度40%～80%，每天喂養(yǎng)正常鼠糧。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程符合《實(shí)驗(yàn)室動物飼養(yǎng)和使用條例》。

1.1.2主要試劑

RGMa RNAi重組腺病毒rAd5-shRNA-RGMa及空載體重組腺病毒rAd5-HK(中國武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司)，Rho激酶特異性抑制劑Y-27632、完全福氏佐劑(美國FCA公司)、MOG31-55多肽(美國Sigma公司)，RGMa多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，Rho激酶多克隆抗體(美國CST公司)，IL-27 ELISA試劑盒(美國R&D公司)，卡介苗(中國生物制品研究所)，百日咳菌液由重慶市渝中區(qū)疾病預(yù)防與控制中心贈送。

1.2 方法

1.2.1EAE模型建立及干預(yù)

MOG31-55多肽用PBS(0.01 mol/mL，pH7.2)稀釋至3.0 mg/mL后，與等體積CFA混合成乳濁液，于小鼠四肢皮下注射免疫(0.2 mL/只)。免疫當(dāng)天記做第0天，分別于免疫后0 h和48 h腹腔注射百日咳菌液(15 μg/kg)[6]，每天觀察小鼠體重、癥狀及神經(jīng)功能評分，評估EAE建模情況。由神經(jīng)功能評分確定造模是否成功，評分大于0分記為造模成功(參見1.2.3部分)，至免疫后第10天神經(jīng)功能評分仍為0分的小鼠視為建模失敗不再納入研究。

1.2.2分組

正常對照組常規(guī)飼養(yǎng)，無任何干預(yù)處理；造模小鼠在免疫后12 d分為EAE模型組、空載體對照組、rAd5-shRNA-RGMa組(RGMa RNAi組)、Rho激酶抑制劑組和PBS組，每組10只。EAE模型組僅造模，無其他特殊處理，RGMa RNAi組和空載體對照組分別于造模后12 d[7]給予側(cè)腦室內(nèi)立體定位注射重組腺病毒rAd5-shRNA-RGMa及空載體重組腺病毒rAd5-HK，轉(zhuǎn)染滴度(2.51×1010pfu/mL，6 μL)參照筆者前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8]。Rho激酶抑制劑組造模后給予Rho激酶特異性抑制劑Y-27632(按體重10 mg/kg[9])，PBS組給予相同體積的PBS。除觀察神經(jīng)功能評分的小鼠，其余在免疫后第18天麻醉處死后取脊髓組織。

1.2.3神經(jīng)功能評分

EAE模型組、RGMa RNAi組及空載體對照組(5 只/組)在免疫當(dāng)天及免疫后每天進(jìn)行神經(jīng)功能評分，連續(xù)觀察21 d。采用通用的5分評分法：0分，正常，無發(fā)病；1分，動物尾無力；2分，雙后肢無力；3分，雙后肢麻痹；4分，雙后肢加前肢癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或死亡。癥狀介于兩級之間則分別記作0.5、1.5、2.5、3.5、4.5分。評分越高代表神經(jīng)功能損傷程度越重。首次觀察到評分大于0.5分記做起病，根據(jù)EAE小鼠神經(jīng)功能先加重后逐漸恢復(fù)的自然病程，評分最高時記做神經(jīng)功能損傷最高峰。

1.2.4Western blot檢測脊髓RGMa和Rho激酶表達(dá)水平

正常對照組及免疫后18 d的各組小鼠腹腔麻醉，斷頭迅速取新鮮脊髓組織，提取全蛋白20 μg上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)，恒壓(濃縮膠80 V，分離膠100 V)分離蛋白,轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃孵一抗過夜，第2天復(fù)溫、TBST漂洗、孵二抗、TBST漂洗后凝膠成像儀成像，結(jié)果用Quantity One軟件進(jìn)行圖像條帶灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.5ELISA檢測各組小鼠血清IL-27的表達(dá)

正常對照組、EAE模型組、空載體對照組、RGMa RNAi組、Rho激酶抑制劑和PBS組免疫后第18天收集小鼠靜脈血，按照ELISA試劑盒說明書，最終所得孔板使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測得各標(biāo)本孔吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過各樣本A值計算出樣本對應(yīng)濃度(pg/mL)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.6蘇木素-伊紅(HE)染色

4 μm石蠟切片通過梯度二甲苯和乙醇依次脫蠟至水，蘇木素染色3～8 min，自來水沖洗，1%的鹽酸乙醇分化，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗后入伊紅染液中染色1～3 min，再依次梯度乙醇及二甲苯脫水透明，封片后顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。炎性細(xì)胞浸潤程度分級依據(jù)文獻(xiàn)[10]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能評分比較

對EAE模型組、RGMa RNAi組及空載體對照組進(jìn)行神經(jīng)功能評分。EAE模型組小鼠自于免疫后第8天起病，神經(jīng)功能損傷逐漸加重，約免疫后第18天神經(jīng)功能損傷達(dá)最高峰?？蛰d體對照組于免疫后免疫后第9天起病，免疫后第18天達(dá)病情最高峰，與EAE模型組相似。而RGMa RNAi組于免疫后第12天起病，免疫后第18天病情達(dá)最高峰。與前兩組比較起病時間明顯推遲，神經(jīng)功能評分明顯降低，神經(jīng)功能損傷明顯減輕，見圖1；同時HE染色結(jié)果也顯示RGMa RNAi組脊髓前角炎性細(xì)胞浸潤程度較空載體對照組明顯減輕(炎性指數(shù)0.72±0.25vs.3.37±0.81，P=0.002)，見圖2。

a：P<0.01，b：P<0.05， 與EAE模型組比較。

A.HE染色；B.炎性指數(shù)；a：P<0.01，與空載體對照組比較。

2.2 Western blot示EAE小鼠RGMa表達(dá)水平

與EAE模型組(0.58±0.09)比較，RGMa RNAi組(0.07±0.01)RGMa相對表達(dá)水平明顯降低(P<0.001)，見圖3A。

2.3 各組小鼠Rho激酶表達(dá)水平比較

與正常對照組(18.23±2.60)小鼠比較，EAE模型組(66.74±8.35)Rho激酶相對表達(dá)水平顯著升高(P=0.038)，空載體對照組(73.02±12.47)Rho激酶表達(dá)與EAE模型組比較無明顯差異，而RGMa RNAi組(42.98±5.69)Rho激酶相對表達(dá)水平較EAE模型組明顯降低(P=0.027)，見圖3B。

A：RGMa;B：Rho激酶。

2.4 各組小鼠IL-27表達(dá)比較

EAE模型組(368.98±30.85)免疫后第18天IL-27表達(dá)水平與正常對照組(1 145.36±134.45)比較顯著升高(P<0.001)。與EAE模型組比較?？蛰d體對照組(1 200.90±163.27，P=0.100)IL-27表達(dá)水平亦較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.010)，而RGMa RNAi組(658.46±83.41，P=0.004)及Rho激酶抑制劑組(804.45±133.90,P=0.022)IL-27的表達(dá)較EAE模型組顯著降低；與PBS組(1 060.73±104.54)比較，Rho激酶抑制劑組IL-27表達(dá)顯著降低(P=0.022)，見圖4。

a：P<0.01，與EAE模型組比較；b：P<0.05,與PBS組比較。

3 討 論

MS是以脫髓鞘、慢性炎性反應(yīng)、軸突破壞為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，MOG誘導(dǎo)的EAE小鼠模型是研究MS等中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫介導(dǎo)的脫髓鞘病的經(jīng)典動物模型。RGMa屬糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定蛋白家族，是近年來新發(fā)現(xiàn)的軸突再生抑制因子，目前發(fā)現(xiàn)其主要作為軸突再生抑制因子抑制神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生，筆者團(tuán)隊(duì)前期利用腺病毒介導(dǎo)的RGMa RNAi干預(yù)缺血再灌注大鼠模型，發(fā)現(xiàn)特異性抑制RGMa的表達(dá)可顯著促進(jìn)缺血再灌注大鼠的軸突出芽，改善神經(jīng)功能損傷程度和炎性細(xì)胞浸潤水平[8]，本研究同樣利用RGMa RNAi特異性抑制EAE小鼠的RGMa表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制RGMa可顯著改善EAE小鼠的神經(jīng)功能損傷程度。MURAMATSU等[4]發(fā)現(xiàn)抑制RGMa可通過抑制T細(xì)胞反應(yīng)抑制MOG誘導(dǎo)的EAE小鼠的炎性反應(yīng)，促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)[3]，這表明RGMa可作用于MS免疫調(diào)節(jié)而發(fā)揮致病作用，但具體作用機(jī)制仍不明確。本研究說明RGMa可通過調(diào)節(jié)EAE小鼠的Rho激酶表達(dá)調(diào)控IL-27的表達(dá)，這可能是RGMa參與MS病理過程的重要分子機(jī)制，同時也進(jìn)一步揭示了RGMa免疫調(diào)控作用的具體方式，但RGMa這一作用是通過免疫細(xì)胞還是非免疫細(xì)胞介導(dǎo)，尚需進(jìn)一步深入探討。

Rho激酶作為RGMa及其受體neogenin的下游信號分子，主要抑制軸突外向性生長，介導(dǎo)RGMa的軸突抑制作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)抑制Rho激酶激活可顯著促進(jìn)MS、脊髓損傷等疾病中的神經(jīng)功能恢復(fù)，提高突觸可塑性[12-13]。本實(shí)驗(yàn)特異性抑制RGMa的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其下游Rho激酶表達(dá)水平亦明顯降低，而EAE小鼠神經(jīng)功能亦明顯恢復(fù)，表明RGMa對EAE小鼠的神經(jīng)抑制作用可能是通過Rho激酶介導(dǎo)的，后期尚需Rho激酶水平的進(jìn)一步干預(yù)研究以驗(yàn)證其在這一通路中的具體分子機(jī)制。此外Rho激酶是否具有免疫調(diào)節(jié)作用尚不明確，本實(shí)驗(yàn)同時顯示RGMa可以通過Rho激酶活性調(diào)控IL-27的表達(dá)水平，有助于深入明確Rho激酶的生物學(xué)功能和信號通路。

IL-12細(xì)胞因子家族包括IL-12、IL-23、IL-27等[14],IL-12、IL-23等作為前炎性細(xì)胞因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致炎性作用已被廣泛證實(shí)。而IL-27盡管目前研究雖少有報道，但已顯示出其在免疫反應(yīng)調(diào)控中具有獨(dú)特作用：IL-27可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的分化，抑制Th2細(xì)胞和Th17細(xì)胞的發(fā)育，具有促炎與抗炎的雙重特征[15]。研究發(fā)現(xiàn)MS患者的IL-27表達(dá)水平明顯升高，星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等均可分泌IL-27，與T淋巴細(xì)胞表面的IL-27受體結(jié)合介導(dǎo)MS的病理損傷。但同時亦有研究發(fā)現(xiàn)IL-27可刺激T細(xì)胞分泌IL-10從而抑制EAE的炎性損傷[16]。目前認(rèn)為上述看似相反的結(jié)論在于研究角度是以IL-27作為病理性前炎性細(xì)胞因子亦或繼發(fā)性宿主反應(yīng)而產(chǎn)生的保護(hù)行為而致[14]，也間接反映了深入研究IL-27的生物學(xué)功能的必要性。本課題組前期利用IL-27受體抑制劑干預(yù)EAE小鼠能明顯緩解中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性損傷程度和神經(jīng)功能損傷[5]，同時結(jié)合本研究進(jìn)一步說明RGMa很可能通過對IL-27的調(diào)控介導(dǎo)EAE小鼠的神經(jīng)功能損傷，也提示在后續(xù)工作中尚需進(jìn)一步開展針對IL-27的特異性干預(yù)措施以深入驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)特異性抑制RGMa可促進(jìn)EAE小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，這一作用可能是通過Rho激酶調(diào)控IL-27的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。這一結(jié)論的發(fā)現(xiàn)有利于深入揭示RGMa參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫介導(dǎo)的脫髓鞘病病理損傷的分子機(jī)制，同時為以MS為代表的中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫介導(dǎo)的脫髓鞘病的臨床治療提供新的思路。