施智男 ，程佳偉，陶金成，張 琳，谷 麗，周 舒，顧麗群，花 卉***

(1 南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院皮膚性病科，南通 226006；2 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3 江蘇省南通市第一人民醫(yī)院皮膚性病科)

當(dāng)人體皮膚過度暴露于太陽光的照射可引起皮膚的損傷。光損傷可分為急性和慢性光損傷。急性光損傷主要表現(xiàn)為紅斑、水腫、色素沉著。而慢性光損傷主要表現(xiàn)為光老化，甚至誘導(dǎo)皮膚惡性腫瘤的發(fā)生。引起皮膚損傷的日光主要是紫外線。紫外線可分為3 種：長波紫外線(ultraviolet A,UVA)、中波紫外線(ultraviolet B,UVB)、短波紫外線(ultraviolet C,UVC)。紫外線波長越長，其穿透能力就越強。能夠穿越大氣層的主要是UVA、UVB。UVA 通過誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生和積聚，間接損傷DNA，UVB 照射則直接損傷DNA，產(chǎn)生環(huán)丁烷嘧啶二聚體(cyclobutane pyrimidine dimers,CPDs)和6-4光產(chǎn)物(6-4 photoproducts,6-4PPs)等細(xì)胞產(chǎn)物，而及時快速地清除細(xì)胞產(chǎn)物可減少細(xì)胞的凋亡，改善皮膚光損傷[1-2]。雖然UVB 大部分都被大氣層吸收，但同等劑量的UVB 和UVA 照射皮膚，UVB 產(chǎn)生的損傷是UVA 的1 000 倍，是造成DNA 損傷的主要原因[3-4]。因此，如何預(yù)防UVB 輻射造成的損傷是防治皮膚光損傷的重要研究方向。

5-氨基酮戊酸光動力療法(5-aminolevulinic photodynamic therapy,ALA-PDT)是一種很常見的無創(chuàng)治療方法，主要由光敏劑、光源和氧構(gòu)成，在病變組織部位給予大量的外源性5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid,ALA)，病變部位吸收產(chǎn)生大量的光敏性物質(zhì)原卟啉Ⅸ，在病變細(xì)胞中蓄積，使用特定波長的光源激活原卟啉Ⅸ，將光能轉(zhuǎn)化為單態(tài)氧、氧自由基等活性氧物質(zhì)從而發(fā)揮功能[5]。在臨床工作中普遍運用的是高劑量ALA-PDT。這種治療方法已經(jīng)成熟應(yīng)用于尖銳濕疣、皮膚腫瘤的治療[6-7]。L.H.GOLDBERG等[8]研究發(fā)現(xiàn)ALA-PDT 可以治療多發(fā)性光化性角化病并預(yù)防皮膚癌的發(fā)生，但具體機制仍不清楚。也有研究[9-10]發(fā)現(xiàn)使用低劑量ALA-PDT 可明顯改善光老化的皮膚，達(dá)到嫩膚的效果。但關(guān)于低劑量ALAPDT 與UVB 誘導(dǎo)的急性光損傷的研究較少。

近年來，隨著高通量測序、生物信息學(xué)的發(fā)展，針對miRNA、lncRNA、circRNA 等非編碼RNA 的研究越來越成熟。miRNA 屬于非編碼小RNA，由19～24 個核苷酸構(gòu)成，通過與靶基因3′非翻譯區(qū)結(jié)合，參與mRNA 轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，可參與調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、分化、凋亡、增殖等細(xì)胞功能[11]。

本課題組前期研究[12]發(fā)現(xiàn)低劑量的ALA-PDT預(yù)處理可活化p53，誘導(dǎo)DNA 的SOS 損傷修復(fù)反應(yīng)，加速清除UVB 誘導(dǎo)的CPDs，減少角質(zhì)細(xì)胞凋亡，對皮膚具有光保護(hù)作用。國內(nèi)學(xué)者[13-14]報道，miR-23a 的表達(dá)水平與紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率有關(guān)，過表達(dá)miR-23a 可減輕細(xì)胞凋亡，減輕光損傷。但是對低劑量ALA-PDT 處理后的miR-23a 表達(dá)水平尚不清楚。本研究使用低劑量ALA-PDT 預(yù)處理人成纖維細(xì)胞，予UVB 照射，檢測miR-23a 的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡情況。

1 材料和方法

1.1 材料來源 新鮮兒童包皮由南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院泌尿外科提供；該研究已通過南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院的倫理審核(批準(zhǔn)文件序列號：E2019001)；DMEM(Dulbecco′s modified Eagle medium)培養(yǎng)基購自Gibco 公司；Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑、青霉素-鏈霉素溶液、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒、胰蛋白酶購自碧云天生物科技公司；ALA 由上海復(fù)旦張江醫(yī)藥生物公司提供；miR-23a 引物、miR-23a inhibitor、miR-23a inhibitor control、U6 均由廣州銳博生物技術(shù)有限公司提供；UVB 輻射燈、紫外線輻射強度儀由上海希格瑪高技術(shù)有限公司生產(chǎn)。FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀由美國BD 公司生產(chǎn)；LED 光譜治療儀購自徐州科諾醫(yī)學(xué)儀器設(shè)備有限公司；實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)儀(型號：CFX Connect)購自Bio-Rad 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞提取、培養(yǎng) 兒童包皮放入含有磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)的離心管中，去除PBS，碘附浸泡9 min，用含有1%青霉素-鏈霉素溶液的PBS 反復(fù)沖洗至無明顯血跡；分離去除包皮皮下組織，剪成0.4～0.5 cm2大?。挥煤?%青霉素-鏈霉素溶液的PBS 沖洗3 次；去除PBS，加入0.5%Dispase 酶消化液，置于4 ℃冰箱中過夜；取出后去除表皮，用0.1%膠原酶消化液浸泡真皮部分，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置50 min，取出后加入含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素溶液的完全培養(yǎng)基，使用吸管反復(fù)吹打，200 目過濾網(wǎng)過濾細(xì)胞；過濾后的細(xì)胞懸液1 000 r/min 離心5 min，去除上清液，加入完全培養(yǎng)基，吹打后放入細(xì)胞瓶中混勻，在37 ℃、含5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；在細(xì)胞密度達(dá)到90%時進(jìn)行傳代，使用3～6 代的人成纖維細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 ALA-PDT 預(yù)處理 使用DMEM 培養(yǎng)基溶解ALA 配置成1 mmol/L 濃度的溶液，孵育人成纖維細(xì)胞4 h，除去培養(yǎng)基，PBS 清洗細(xì)胞，覆蓋少量PBS防止細(xì)胞干涸，置于光動力治療儀下，使用635 nm的紅光輻射，距離10 cm，功率為50 mW/cm2，照射劑量為9 J/cm2，照射180 s，完成后去除PBS，加入完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)生長。

1.2.3 UVB 輻射 取75%融合度的成纖維細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，加少量PBS，置于UVB 輻射燈下，燈管距離培養(yǎng)皿15 cm，UVB 輻射強度儀檢測熒光燈輻射強度，輻射劑量=時間×輻射強度。完成后吸盡PBS，加入完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 實驗分組 對照組為正常生長的人成纖維細(xì)胞，未予其他處理；UVB 組細(xì)胞予UVB 60 mJ/cm2照光；ALA-PDT+UVB 組先予ALA-PDT(1 mmol/L，9 J/cm2)處理后培養(yǎng)24 h，然后使用60 mJ/cm2劑量的UVB 照射。

1.2.5 qRT-PCR 去除培養(yǎng)基，每皿加入1 mL Trizol，吹打收集細(xì)胞至EP 管中，室溫放置5 min，每管中加入200 μL 氯仿，顛倒混勻15 s，12 000 g 4 ℃離心10 min，吸取上層無色水相至新的EP 管，加入相等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min，12 000 g 4 ℃離心10 min，去除上清，加入1 mL 75%乙醇溶液，7 500 g 4 ℃離心5 min，吸盡液體，收干后檢測RNA 濃度。將測得的RNA 產(chǎn)物加入10 μL 的Poly(A) Tailing 反應(yīng)體系，37 ℃反應(yīng)1 h。然后制備20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系，42 ℃反應(yīng)1 h，72 ℃孵育10 min，得到所需cDNA。最后制備20 μL qRT-PCR 反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：95 ℃反應(yīng)10 min，循環(huán)1 次；95 ℃反應(yīng)2 s、60 ℃反應(yīng)20 s、70 ℃反應(yīng)10 s，循環(huán)40 次。上述反應(yīng)程序按照廣州銳博生物技術(shù)有限公司miRNA qRT-PCR 試劑盒使用說明進(jìn)行實驗。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h 進(jìn)行細(xì)胞接種，每孔細(xì)胞數(shù)700 000 個，等待細(xì)胞密度達(dá)70%，去除培養(yǎng)基，更換新鮮完全培養(yǎng)基。清潔離心管中先后加入DMEM 培養(yǎng)基、適量稀釋后miR-23a inhibitor、miR-23a inhibitor control 和Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫放置20 min，加入至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.2.7 流式細(xì)胞檢測 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液至對應(yīng)離心管中，PBS 輕柔沖洗貼壁細(xì)胞，加入適量胰酶消化，收集細(xì)胞至對應(yīng)離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄除上清液，用PBS 輕輕重懸細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，使用Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色。室溫避光放置20 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。Annexin V(+)/PI(+)為晚期凋亡，Annexin V(+)/PI(-)為早期凋亡，總凋亡率為兩者相加之和。

2 結(jié) 果

2.1 ALA-PDT 預(yù)處理增強miR-23a 表達(dá) 采用qRT-PCR 法檢測對照組、UVB 組、ALA-PDT+UVB組的miR-23a 表達(dá)情況，相較于對照組，UVB 組的miR-23a 表達(dá)量增加，而經(jīng)ALA-PDT 處理后，miR-23a 的表達(dá)量較UVB 組明顯增高(P<0.05)(圖1)。

圖1 qRT-PCR 分析miR-23a 在各組中的表達(dá)（*P<0.05）

2.2 抑制miR-23a 可降低ALA-PDT 預(yù)處理對UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制 為了進(jìn)一步驗證ALAPDT 預(yù)處理對miR-23a 的調(diào)控作用，構(gòu)建了miR-23a 抑制物的小干擾RNA。將這些寡核苷酸序列轉(zhuǎn)染到人成纖維細(xì)胞中，首先驗證了miR-23a 抑制物可抑制miR-23a 的表達(dá)，miR-23a-inhibitor 組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)，然后進(jìn)行功能實驗。分組為對照組、UVB 組、ALA-PDT+UVB組、ALA-PDT+miR-23a-inhibitor+UVB 組、ALAPDT+inhibitor-control+UVB 組。通過流式細(xì)胞儀定量檢測，UVB 組凋亡率為(24.8±1.81)%，ALA-PDT+UVB 組細(xì)胞凋亡率顯著下降(15.62±2.24)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ALA-PDT+miR-23ainhibitor+UVB 組細(xì)胞凋亡率(25.81±2.53)%，與ALAPDT+UVB 組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖2 qRT-PCR 檢測miR-23a 在各組中的表達(dá)（*P<0.05）

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率（***P<0.001）

3 討 論

miR-23a 主要作用的靶基因有FUT9、ETNK1、STK4、RAB39B、TOP1、CASP7 等，分別參與物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、DNA 復(fù)制、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞功能調(diào)控，而發(fā)揮作用的差異主要與靶細(xì)胞的特性有關(guān)[15]。在不同的靶細(xì)胞中，miR-23a 通過調(diào)控多種靶基因和信號通路參與發(fā)揮促凋亡和抗凋亡的作用。J.MAO 等[16]在心機梗死的治療中發(fā)現(xiàn)，miR-23a可以通過調(diào)控Caspase-7 參與腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，過表達(dá)的miR-23a 可以保護(hù)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的凋亡，通過移植間充質(zhì)干細(xì)胞過表達(dá)miR-23a 可以縮小心肌梗死的范圍。研究[17]表明，在動脈粥樣硬化疾病中，過表達(dá)miR-23a 可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子HSP90 抑制NF-κB 通路降低巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的凋亡，減輕癥狀。但是同樣在冠心病中，miR-23a 與冠心病的風(fēng)險程度呈正相關(guān)[18]。而在有關(guān)結(jié)腸癌的報道[19]中，miR-23a 可通過APAF-1/Caspase-9 途徑抑制氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這也是miR-23a 與凋亡相關(guān)性的表現(xiàn)。

miR-23a 在皮膚光損傷中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，且已被多次作為重要的治療靶點進(jìn)行報道。在紫外線照射引起的急性光損傷中，UVB 照射后，細(xì)胞DNA 受損，生成CPDs 和6-4PPs，p53 通路被激活，細(xì)胞周期阻滯，當(dāng)生成的光產(chǎn)物不能被及時修復(fù)清除，則會通過細(xì)胞凋亡方式來清除受損細(xì)胞。而過表達(dá)miR-23a 可抑制UVB 誘導(dǎo)的Caspase-7 和Caspase-3 活化，調(diào)控內(nèi)源性的凋亡通路，加快CPDs的清除速度，最終減少UVB 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。研究[2,20]發(fā)現(xiàn)黃芩苷預(yù)處理可誘導(dǎo)miR-23a 過表達(dá)，通過減輕生長抑制、細(xì)胞周期阻滯，加速光產(chǎn)物CPDs的清除，加快DNA 損傷修復(fù)、p53 蛋白表達(dá)和降低細(xì)胞凋亡率，發(fā)揮光保護(hù)的作用。本課題組之前研究[12]已證明低劑量ALA-PDT 預(yù)處理產(chǎn)生的低劑量的ROS，通過激活p53 通路提前誘導(dǎo)保護(hù)性的DNA 損傷修復(fù)，加快CPDs 產(chǎn)物的清除，減少凋亡，減輕UVB 導(dǎo)致的皮膚光損傷，但具體的調(diào)控機制仍需進(jìn)一步探究。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量ALA-PDT 預(yù)處理人成纖維細(xì)胞可顯著提高miR-23a 的表達(dá)水平，而UVB 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡則明顯減少，當(dāng)miR-23a 的表達(dá)被抑制時，低劑量ALA-PDT 預(yù)處理減輕凋亡的作用也被抑制。這與上述文獻(xiàn)中關(guān)于miR-23a 在急性光損傷細(xì)胞模型中的表達(dá)變化以及發(fā)揮光保護(hù)作用有著類似的結(jié)果。這可能就是低劑量ALA-PDT預(yù)處理調(diào)控miR-23a 改善UVB 所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的機制。在最新的研究中我們也試圖從低劑量ALA-PDT 調(diào)控凋亡通路進(jìn)行驗證。另外也有報道[21]在光老化過程中，miR-23a 可以調(diào)控細(xì)胞自噬，減輕紫外線輻射導(dǎo)致的皮膚光老化現(xiàn)象。是否在急性光損傷中也存在類似的調(diào)控機制，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低劑量ALA-PDT 預(yù)處理可上調(diào)miR-23a 減輕UVB 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞凋亡，為低劑量ALA-PDT 預(yù)處理防護(hù)UVB 損傷提供新的研究依據(jù)和研究方向，但具體的分子機制有待于進(jìn)一步研究。