吳姚鈺，沈 熙，宋 偉，吳 堅(jiān)

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，南通 226001)

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的原始細(xì)胞。干細(xì)胞在生物學(xué)領(lǐng)域被廣泛研究，其在再生醫(yī)學(xué)和治療方面的潛力越來(lái)越受到關(guān)注[1-3]。干細(xì)胞治療從實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究發(fā)展至逐漸應(yīng)用于臨床的疑難病癥[4-5]。目前，國(guó)內(nèi)的各大三甲醫(yī)院和科研院校積極合作，開(kāi)展干細(xì)胞臨床治療研究。為了規(guī)范臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的質(zhì)量，國(guó)家陸續(xù)出臺(tái)了多項(xiàng)政策，其中《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》做了詳細(xì)的規(guī)定。本研究檢測(cè)領(lǐng)航干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)工程有限公司提供的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)懸液制劑的凝血性和溶血性，并通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，觀察hUCMSCs 生物急性毒性反應(yīng)，為進(jìn)一步研究其慢性毒性、成瘤性、異常免疫反應(yīng)等生物學(xué)安全問(wèn)題，提供前期的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 體外凝血性實(shí)驗(yàn)

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭兔(邳州市東方養(yǎng)殖有限公司)，雄性，2 000 g。

1.1.2 主要材料和儀器 兔血，枸櫞酸鈉(草本源生物)，CaCl2、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)測(cè)定試劑盒、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)測(cè)定試劑盒(長(zhǎng)島生物)等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)分組 hUCMSCs 組：濃度為1×107/mL hUCMSCs，按低、中、高不同容量(0.1、0.25、0.5 mL)分別加入不同體積(2.4、2.25、2.0 mL)生理鹽水，各取20 μL。生理鹽水組：20 μL 生理鹽水。自然凝血組：20 μL 非抗凝新鮮兔血。

1.1.4 PT 測(cè)定 新鮮兔血與3.8%枸櫞酸鈉按9∶1混合，3 000 r/min 離心15 min，取上層血漿，即貧血小板血漿。各取0.1 mL 分別加入各組樣本，37 ℃孵育3 min，加入37 ℃預(yù)溫PT 試劑0.2 mL，記錄凝固時(shí)間，即為PT 值。

1.1.5 APTT 測(cè)定 同上法獲得貧血小板血漿。各取0.1 mL 分別加入各組樣本及37 ℃預(yù)溫APTT 試劑0.1 mL，37 ℃孵育5 min，加入37 ℃預(yù)溫0.025 mol/L CaCl2溶液0.1 mL，記錄凝固時(shí)間，即為APTT 值。

1.2 體外溶血性實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭兔(邳州市東方養(yǎng)殖有限公司)，雄性，2 000 g。

1.2.2 主要材料和儀器 兔血、酶標(biāo)儀(Biotek)等。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 濃度為1×107/mL hUCMSCs，按低、中、高不同容量(0.1、0.25、0.5 mL)分別加入不同體積(2.4、2.25、2.0 mL)生理鹽水和2.5 mL 的2%兔紅細(xì)胞混懸液中，同時(shí)以生理鹽水和滅菌蒸餾水分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)步驟 取新鮮抗凝兔血2 mL，3 000 r/min離心5 min。棄上清，加入5 mL 生理鹽水，吹散管底紅細(xì)胞，3 000 r/min 離心5 min。重復(fù)以上步驟，直至離心后上清液透亮，取底部壓積紅細(xì)胞加入適量生理鹽水，制備2%紅細(xì)胞懸液。

將各組樣品置于37 ℃恒溫箱孵育0.5 h 后，加入2.5 mL 預(yù)熱的2%紅細(xì)胞懸液，37 ℃恒溫箱繼續(xù)孵育1 h，2 000 r/min 離心5 min，分別吸取上清于96 孔板中，100 μL/孔，使用酶標(biāo)儀在545 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。溶血率=(樣品吸收-陰性對(duì)照吸收)/(陽(yáng)性對(duì)照吸收-陰性對(duì)照吸收)×100%。溶血率≥5%視為溶血。

1.3 體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心培育的ICR 小鼠，23～25 g，每組各時(shí)間點(diǎn)雌雄各半，各5 只。

1.3.2 主要材料和儀器 胰島素注射針(尾靜脈注射用)、軟蠟(熔點(diǎn)50～52 ℃)、硬蠟(熔點(diǎn)56～58 ℃)、蘇木精、伊紅、石蠟切片機(jī)、正置顯微鏡(Leica)等。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 生理鹽水組、hUCMSCs 高(1×108/kg)、中(2×107/kg)、低(2×106/kg)劑量組。

1.3.4 動(dòng)物模型制備 經(jīng)尾靜脈注射hUCMSCs。飼養(yǎng)于屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)室，使用許可證號(hào)為SYXK(蘇)2017-0046。連續(xù)觀察2 周，記錄動(dòng)物的行為、毛色、呼吸、排便等，2 周后處死，取各系統(tǒng)主要臟器行石蠟包埋、切片、HE 染色觀察。研究方案獲南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 hUCMSCs 未引起凝血異常 各組PT、APTT 比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表1)，表明hUCMSCs未影響機(jī)體的凝血機(jī)制。

表1 各組PT、APTT 比較(,n=6)

表1 各組PT、APTT 比較(,n=6)

2.2 hUCMSCs 未引起溶血反應(yīng) 體外溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低、中、高濃度的hUCMSCs 對(duì)兔血的溶血率均＜5%(圖1)，說(shuō)明均未引起溶血反應(yīng)。

圖1 不同劑量hUCMSCs 溶血性檢測(cè)

2.3 hUCMSCs 未引起急性毒性反應(yīng) ICR 小鼠經(jīng)尾靜脈注射hUCMSCs 后，各組動(dòng)物在觀察期內(nèi)，體質(zhì)量穩(wěn)步增加，毛色鮮亮，呼吸均勻，排便干燥成顆粒狀，行為正常，未見(jiàn)消瘦、呼吸困難、焦躁、萎靡、稀便等不良癥狀。2 周后取各系統(tǒng)的主要器官經(jīng)石蠟包埋、切片、HE 染色觀察，均未見(jiàn)炎癥、壞死、腫瘤等病理變化(圖2)。

圖2 經(jīng)尾靜脈注射hUCMSCs 2 周后小鼠各系統(tǒng)主要器官的HE 染色(200×)

3 討 論

國(guó)內(nèi)干細(xì)胞實(shí)行雙軌制，已有119 家機(jī)構(gòu)74 個(gè)干細(xì)胞臨床研究項(xiàng)目完成臨床備案，幾乎涉及臨床的各個(gè)領(lǐng)域。間充質(zhì)干細(xì)胞可從骨髓、羊水、臍帶、脂肪等多種組織中獲得[6]。在干細(xì)胞臨床備案的項(xiàng)目中，涵蓋了各種類型的間充質(zhì)干細(xì)胞，而其中hUCMSCs 占比最大(43%)，這與組織采集簡(jiǎn)單，易消毒、干細(xì)胞數(shù)量多、細(xì)胞易于純化等特點(diǎn)密切相關(guān)。hUCMSCs 來(lái)源于人臍帶的膠質(zhì)組織[7]，與其他來(lái)源的干細(xì)胞相比，具有免疫原性低、非侵入性采集、生物學(xué)性能穩(wěn)定、增殖快，且不存在倫理問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)[8-10]，故備受關(guān)注。因此，hUCMSCs 是一種更有前途的細(xì)胞治療方法。

用于臨床疾病治療的hUCMSCs 絕大多數(shù)都不是來(lái)源于患者自身，不同來(lái)源及不同實(shí)驗(yàn)室制備的hUCMSCs 在質(zhì)量方面必定存在著很大的差異，在臨床治療前必須進(jìn)行全面的安全性評(píng)估。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前，首先用兔血檢測(cè)了hUCMSCs 的凝血性和溶血性，結(jié)果表明hUCMSCs 未引起凝血異常和溶血反應(yīng)。在基本排除hUCMSCs 進(jìn)入體內(nèi)不會(huì)引發(fā)血栓或溶血的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)是臨床應(yīng)用前必須要做的完全性評(píng)價(jià)，目的是觀察全身性毒性反應(yīng)，主要是動(dòng)物有無(wú)不良生理反應(yīng)甚至死亡，全身各器官有無(wú)不良病理變化。而剛進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，濃度最高，反應(yīng)也最大，因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是hUCMSCs 在小鼠體內(nèi)急性毒性反應(yīng)，觀察2周內(nèi)小鼠的生理狀態(tài)，2 周后取材觀察各器官的病理變化。細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)的方法是通過(guò)尾靜脈注射，可以使hUCMSCs 到達(dá)更多的器官，特別是血供豐富的臟器，如心、肝、脾、肺、腎等[11]。目前臨床上hUCMSCs擬輸入劑量為1×106個(gè)細(xì)胞/kg 體質(zhì)量[12]，作為安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，所用劑量應(yīng)遠(yuǎn)大于臨床使用劑量，因此本研究選擇低(2×106/kg)、中(2×107/kg)、高(1×108/kg) 3個(gè)劑量組，最高劑量是臨床用量的100 倍。低、中、高劑量的hUCMSCs 通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，2 周內(nèi)各組動(dòng)物均無(wú)死亡，未表現(xiàn)出不正常的生理反應(yīng)。2 周后對(duì)各系統(tǒng)主要器官取材、石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下未見(jiàn)明顯病理改變。

綜上所述，hUCMSCs 在體外未引起凝血或溶血異常，經(jīng)尾靜脈注射后，對(duì)ICR 小鼠各系統(tǒng)主要器官無(wú)明顯刺激性作用，動(dòng)物無(wú)不良反應(yīng)。結(jié)果初步表明領(lǐng)航干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)工程有限公司制備的hUCMSCs 制劑對(duì)動(dòng)物未造成急性毒性反應(yīng)，為以后進(jìn)行慢性毒性、成瘤性、異常免疫反應(yīng)等生物學(xué)安全檢測(cè)提供了前期的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。