彭靈娜，孫 華，丁瑩瑩，王生存，郭 豐,***

(1 南通大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南通 226001；2 南通大學(xué)實驗動物中心)

目前惡性腫瘤患者呈現(xiàn)越來越年輕化的趨勢。得益于腫瘤治療的進展，越來越多的腫瘤患者可達到長期生存，然而大部分腫瘤治療方法可導(dǎo)致性腺功能減退甚至喪失生育功能，因此對于腫瘤治療后的生育力的保存日益得到關(guān)注?；熀头暖熓悄[瘤治療的重要手段，但卵巢組織對細(xì)胞毒性藥物非常敏感，許多藥物被歸類為性腺功能障礙高風(fēng)險的藥物[1]?；煹闹饕幬锃h(huán)磷酰胺是以劑量依賴的方式損害卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞[1]。盆腔放療作為婦科惡性腫瘤治療的有效輔助手段也可能導(dǎo)致卵巢功能損害，<2 Gy 的卵巢放射量足以破壞約50%的原始卵泡，而當(dāng)劑量增大至20 Gy 時整個卵巢的功能將會完全喪失[2]。惡性腫瘤的治療勢必會導(dǎo)致早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)，最終致使女性喪失生育能力。因此，癌癥治療前的生育力保存非常必要。

女性患者的生育力保存主要包括卵子冷凍、胚胎冷凍和卵巢組織冷凍，現(xiàn)階段卵子冷凍與胚胎冷凍技術(shù)已經(jīng)成熟，而卵巢組織冷凍保存尚處于實驗階段。自2004 年J.DONNEZ 等[3]報道了首例慢速冷凍卵巢組織復(fù)蘇后經(jīng)自體移植得到活產(chǎn)嬰兒，目前這項技術(shù)已經(jīng)帶來了超過130 例的活產(chǎn)兒[4]。傳統(tǒng)的卵巢組織冷凍方法為慢速冷凍，與玻璃化冷凍相比，其耗時長且需要較為昂貴的設(shè)備[5]。玻璃化冷凍技術(shù)現(xiàn)已被廣泛地運用于配子和胚胎的冷凍保存，其方法較為簡單，能夠減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成[5-7]，減少原始卵泡中的DNA 碎片[8]，更好地保護了卵巢的間質(zhì)細(xì)胞[8-11]。

表觀遺傳學(xué)是指在不改變基因核酸序列的情況下，發(fā)生的可遺傳的基因表達改變，其調(diào)控的基本機制包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和RNA 的逆轉(zhuǎn)錄[12]。而DNA 甲基化是重要的表觀遺傳學(xué)修飾，可使某些基因失活引起DNA 構(gòu)象的改變，影響DNA 穩(wěn)定性及DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的方式。而異常的甲基化模式會導(dǎo)致發(fā)育異?；蚰承┌┌Y的發(fā)生。DNA 甲基化是由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)所催化的，甲基化可隨DNA 的復(fù)制遺傳給后代，DNA 復(fù)制后，DNMT 可將新合成的未甲基化位點進行重新的甲基化。DNMT 催化甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至DNA。在哺乳動物中，已報道DNMT家族的5 個成員：DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b 和DNMT3L，但只有DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性[13]。DNMT1 是維持甲基化酶，主要負(fù)責(zé)維持DNA 復(fù)制期間的甲基化模式，DNMT3a 和DNMT3b 為從頭甲基化酶，有助于在胚胎和生殖細(xì)胞中產(chǎn)生從頭DNA 甲基化模式[14]。母系表達的H19 基因位于小鼠7 號染色體遠(yuǎn)端的許多印記基因附近，該區(qū)域的其他基因有父系表達的Igf2 和Ins2 基因以及母系表達的p57KIP2、Kvlqt1 和Mash2 基因[15]。H19 基因編碼一種非翻譯mRNA，可以抑制胎兒和胎盤的發(fā)育[16]。有關(guān)胚胎配子玻璃化冷凍對表觀遺傳學(xué)的影響已有多篇報道[17-19]。卵巢組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所含細(xì)胞種類繁多，目前還沒有統(tǒng)一的卵巢玻璃化冷凍方案，玻璃化冷凍是否對卵巢表觀遺傳產(chǎn)生影響仍存在爭論。本研究旨在探討玻璃化冷凍方法對小鼠卵巢的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的影響以及 對DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 和H19 的mRNA表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 8 周齡無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級C57BL/6J 雌性小鼠，均由南通大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級屏障設(shè)施配套IVC 籠盒，12 h 明和12 h 暗的光周期，飼喂全價營養(yǎng)配合飼料，高溫高壓滅菌飲水自由飲用。本實驗方案由南通大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 蔗糖、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、乙烯乙二醇(ethylene glycol,EG)均購自Sigma-Aldrich 公司；血清蛋白(human serum albumin,HSA)、G-MPOS 緩沖液為Vitrilife 產(chǎn)品(Sweden)；實驗所采用的實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒購自上海生工公司。

1.3 主要設(shè)備 眼科剪、顯微手術(shù)鑷均購自德國Eppendorf 公司，SMZ745 體視顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司，液氮罐、分光光度計、普通PCR 儀均購自德國Thermo Scientific 公司，Stepone real-time PCR 儀購自美國ABI 公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 卵巢組織收集 將8 周齡的C57BL/6J 雌性小鼠隨機分為冷凍組和對照組，小鼠脫頸椎處死后，快速打開腹腔，找到并取出卵巢組織，置于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)中，去除周圍脂肪組織。冷凍組的卵巢組織進行玻璃化冷凍保存，對照組的新鮮卵巢組織用于即刻實驗。

1.4.2 卵巢組織的玻璃化冷凍保存與復(fù)蘇 使用本實驗室的卵巢組織冷凍復(fù)蘇方法[20]，此方法可有效地保存卵巢組織，復(fù)蘇移植后可成功存活。將卵巢組織置于冷凍液1 中平衡5 min，再移入冷凍液2 中直至完全下沉，轉(zhuǎn)移到1.5 mL 的凍存管中，快速投入液氮罐中進行冷凍保存。冷凍保存至少2 個月以上取出復(fù)蘇，復(fù)蘇液1 中1 min，復(fù)蘇液2 中5 min，置于PBS 中備用。

1.4.3 卵巢組織HE 染色 將卵巢組織固定于4%多聚甲醛溶液中，12 h 后用三蒸水充分換洗，經(jīng)70%、80%、90%及無水乙醇梯度脫水后于二甲苯中透明，于已融化的石蠟中浸蠟包埋，5 μm 切片，45 ℃溫水中漂片，貼于載玻片上，63 ℃烘片。依次置于二甲苯，無水乙醇，90%、80%及70%乙醇中脫蠟，蘇木精染色20 min，鹽酸乙醇分化30 s，伊紅染色30 s，經(jīng)梯度乙醇及二甲苯脫水透明，中性樹膠封固。

1.4.4 卵巢組織電鏡切片的制備 將卵巢固定于3%戊二醛溶液中，48 h 后用PBS 充分換洗，于10 g/L四氧化鋨中固定1 h，PBS 沖洗，30%～100%丙酮梯度脫水，環(huán)氧丙烷浸泡5 h，Epon812 定向包埋，半薄切片光學(xué)定位，超薄切片機切片，片厚50 nm，貼附于載網(wǎng)上，用醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4.5 qRT-PCR 將卵巢組織置于Trizol 中提取組織中的總RNA，按照Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA 的合成，反應(yīng)條件如下：42 ℃2 min，37 ℃15 min，85 ℃加熱5 s，得到的cDNA 置-20 ℃保存。qRT-PCR 試劑盒購自上海生工公司，20 μL 擴增體系為：cDNA 模板5 μL，Mix 10 μL，10 μmol/L 上下游引物(表1)各0.6 μL，DEPC 水3.8 μL。PCR 擴增程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，共45 個循環(huán)。

表1 實時熒光定量PCR 引物

1.4.6 統(tǒng)計學(xué)方法 qRT-PCR 反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)所得的Ct 值計算各mRNA 的相對表達量。以GAPDH為內(nèi)參，各基因的相對表達量以2-△△Ct表示。使用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(K-W 秩和檢驗)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢組織HE 染色 冷凍組卵巢的形態(tài)與對照組相似，小鼠卵巢中可見大小不等的各級卵泡，卵泡形態(tài)規(guī)則，卵泡腔較大且卵泡液豐富，顆粒細(xì)胞排列緊密，卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，核仁明顯，卵巢皮質(zhì)下可見較多的始基卵泡和初級卵泡，黃體細(xì)胞豐富，偶見閉鎖卵泡(圖1A～B)?？傊鋬霰４鎻?fù)蘇后的卵巢組織形態(tài)保存的較為完整。

2.2 卵巢組織的超微結(jié)構(gòu) 冷凍組卵巢組織及卵泡超微結(jié)構(gòu)顯示，卵巢細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞胞質(zhì)及間質(zhì)中可見大量的線粒體、脂滴及其他細(xì)胞器，尤其是參與細(xì)胞有氧呼吸的重要細(xì)胞器——線粒體的結(jié)構(gòu)與對照組卵巢組織非常相似(圖1C～D)。超微結(jié)構(gòu)上未觀察到冷凍復(fù)蘇過程帶來的明顯損傷。

圖1 光鏡及電鏡下卵巢組織

2.3 卵巢組織DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶及H19 基因的相對表達 為了解卵巢組織玻璃化冷凍復(fù)蘇是否影響基因組DNA 的甲基化水平，通過qRT-PCR 檢測了3種DNMT 及H19 基因的表達，結(jié)果顯示冷凍組卵巢中DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 的表達高于對照組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；H19 基因的相對表達量較對照組稍有下降，但兩者亦無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見圖2。

圖2 卵巢組織DNMT 及H19 基因的相對表達水平

3 討 論

相較于卵母細(xì)胞冷凍和胚胎冷凍，卵巢組織冷凍具有以下獨特的優(yōu)勢：首先，對于卵母細(xì)胞冷凍保存，將卵巢組織進行冷凍保存有利于保護卵泡發(fā)育的天然微環(huán)境，更利于復(fù)蘇后卵細(xì)胞的繼續(xù)發(fā)育。其次，卵巢組織冷凍保存尤其適用于青春期前和沒有配偶的腫瘤患者，因其無需額外的卵巢刺激，不需要推遲癌癥的治療。最后，卵巢組織冷凍保存除具有保存女性生育能力外，還可恢復(fù)女性的內(nèi)分泌功能。2010 年S.SILBER 等[21]首次將玻璃化冷凍技術(shù)用于卵巢組織冷凍，盡管目前尚無玻璃化冷凍卵巢組織的活產(chǎn)嬰兒出生，但玻璃化冷凍青春前期的小鼠卵巢組織并進行同種異體移植，結(jié)果顯示小鼠恢復(fù)了青春期及生育能力[22]。雖然冷凍保存技術(shù)與手術(shù)的可行性已有大量研究[3-4,21-22]支持，但在冷凍過程中，可能會因冷凍保護劑(如DMSO、EG 等)的濃度、溫度及暴露時間對細(xì)胞產(chǎn)生毒性[23-24]。目前對于冷凍保存卵巢組織的安全性問題研究較少。

DNA 甲基化作為重要的表觀遺傳學(xué)修飾之一，由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶催化。在哺乳動物中，DNA 甲基化模式在配子發(fā)生和胚胎早期就已經(jīng)建立，DNA 甲基化對于基因的沉默、基因組的印記及X 染色體的失活非常重要[25]。多種人類疾病也與DNA 的異常甲基化狀態(tài)有關(guān)，如癌癥、脆性X 和Rett 綜合征[13,26]。玻璃化冷凍是否影響卵母細(xì)胞或胚胎的表觀遺傳學(xué)尚無統(tǒng)一意見。支持者認(rèn)為由于卵母細(xì)胞或胚胎玻璃化冷凍引起的表觀遺傳學(xué)變異可能會遺傳給后代[27-29]，且會使后代患有其他疾病的風(fēng)險升高[19]。R.THALER 等[14]認(rèn)為作為玻璃化冷凍的重要成分DMSO 改變了胚胎干細(xì)胞的表型，從而影響了全基因組DNA 甲基化的水平。M.IWATANI 等[30]研究發(fā)現(xiàn)隨著DMSO 濃度的增加DNMT3a mRNA 的表達量也相應(yīng)增加。但也有不同觀點，T.TRAPPHOFF 等[7]研究了卵泡冷凍對卵子發(fā)育成熟、DNA 完整性和甲基化水平的影響，發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍會導(dǎo)致短暫的DNA 斷裂增加、延緩卵泡發(fā)育，但卵母細(xì)胞的生長成熟、紡錘體和染色體構(gòu)成與對照組無明顯差異，玻璃化冷凍也不增加印記基因的突變水平。李尚等[31]認(rèn)為玻璃化冷凍對基因組甲基化模式或相關(guān)基因mRNA 表達水平無明顯影響，對DNA 甲基化不同的研究結(jié)果可能與冷凍保護劑的種類和濃度、冷凍復(fù)蘇操作方法及使用的培養(yǎng)基不同有一定的關(guān)系。

卵巢組織玻璃化冷凍與DNA 甲基化的研究不多，H.Y.WANG 等[22]研究了玻璃化冷凍10 日齡的小鼠卵巢組織，發(fā)現(xiàn)其Snrpn-DMR 區(qū)域的甲基化譜沒有改變。黃麗麗等[32]研究顯示無論是程序化冷凍還是玻璃化冷凍均不能對人卵巢組織中印記基因胰島素樣生長因子2/H19CpG 島甲基化程度及表達產(chǎn)生影響。但Z.Y.HE 等[33]研究顯示玻璃化冷凍卵巢組中濾泡DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白減少，導(dǎo)致了啟動子區(qū)域的超甲基化使得Grb10 的表達增加。本研究觀察到玻璃化冷凍方法可完好地保存卵巢組織，解凍復(fù)蘇后不影響卵巢組織的超微結(jié)構(gòu)，各細(xì)胞及細(xì)胞器保存完整；qRT-PCR 結(jié)果顯示玻璃化冷凍的卵巢與新鮮的卵巢相比，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 及H19基因的表達均沒有明顯變化。

本研究尚存在一些不足之處：由于課題經(jīng)費的限制，沒有對玻璃化冷凍的卵巢組織進行全基因組DNA 甲基化水平的檢測，這將是以后的研究重點。對于復(fù)蘇后的卵巢組織中主要遺傳物質(zhì)——卵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及其表觀遺傳學(xué)的變化也值得探索。

本研究表明玻璃化冷凍對卵巢組織的結(jié)構(gòu)、DNMT 及H19 基因的表達無明顯影響。卵巢冷凍保存的目的是日后移植回體內(nèi)恢復(fù)機體內(nèi)分泌功能和生殖功能并獲得子代，安全的卵巢冷凍是子代健康的前提，所以玻璃化冷凍卵巢組織的DNA 甲基化狀態(tài)尚需更多深入細(xì)致的研究。