湯曉璇，顧心逸，陳曉莉，凌 玨*，楊宇民*

(南通大學(xué) 教育部/江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001)

眾多研究[1-6]已證明水凝膠是在三維(3D)環(huán)境中用于細(xì)胞培養(yǎng)的合適且生物相容的材料。細(xì)胞負(fù)載有望將活細(xì)胞或工程化的組織構(gòu)建體有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至目標(biāo)部位，然后發(fā)揮治療作用，修復(fù)受損的組織或器官。

組織損傷是最常見(jiàn)的臨床問(wèn)題，其傷口的閉合也至關(guān)重要。目前，外科手術(shù)后60%的傷口通過(guò)縫合或縫合釘閉合[7]。但在機(jī)械移除不可降解的縫線或縫合釘時(shí)，由于軟組織的脆弱性和局部應(yīng)力可導(dǎo)致繼發(fā)性損傷，因此有必要開(kāi)發(fā)醫(yī)用粘合劑，無(wú)縫合傷口閉合以簡(jiǎn)化手術(shù)程序，縮短恢復(fù)時(shí)間，并提高患者的護(hù)理質(zhì)量[8]。

在水凝膠內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞封裝和3D 細(xì)胞培養(yǎng)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。首先，與預(yù)制的多孔支架相比，通過(guò)各種啟動(dòng)策略對(duì)細(xì)胞懸浮的前體溶液進(jìn)行相容且快速的固化(幾秒鐘到幾分鐘)，細(xì)胞能夠在水凝膠中均勻地分布[9-11]。此外，凝膠前體溶液可以填充到任何形狀的組織缺損中，匹配各類(lèi)傷口，以確保與宿主組織的空間適應(yīng)性[12]。最后，從納米凝膠顆粒到宏觀體系的構(gòu)建，水凝膠可以滿(mǎn)足生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的實(shí)際要求[13-14]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量為180～250 g，雄性。L929 小鼠成纖維細(xì)胞系從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)取。大腸埃希菌菌種、金黃色葡萄球菌菌種從中國(guó)微生物菌種保藏中心購(gòu)取。

1.2 主要試劑及儀器 海藻酸鈉(sodium alginate,SA)、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉(上海阿拉丁生化科技有限公司)；殼聚糖(南通興成生物有限公司)；丙烯酰胺(上海麥克林生化科技有限公司)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽[1-(3-Dimethy laminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC](TCI)；2-(N-嗎啉代)乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid,MES)緩沖液、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N′-methylenebisacrylamide,MBAA)、四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine,TEMED)、過(guò)硫酸銨(ammonium persulphate,APS)、硫酸鈣(CaSO4)(Sigma-Aldrich)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)(HyClone)；DMEM 高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco)；氯化鈉(NaCl)、葡萄糖、蔗糖(西隴化工股份有限公司)；活死細(xì)胞染色試劑盒(Molecular Probes)；戊巴比妥鈉(Sigma)；0.9%氯化鈉溶液(山東齊都藥業(yè)有限公司)；多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；伊紅-蘇木精染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；中性樹(shù)脂(上海索橋生物技術(shù)有限公司)。電熱恒溫磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；分析電子天平(日本SHIMADZU 公司)；超純水儀(Millipore)；冰凍切片機(jī)(Leica CM3050S)；共聚焦激光掃描顯微鏡(德國(guó)萊卡)；ZEISS-AX10 正置研究級(jí)光學(xué)顯微鏡(ZEISS)。

1.3 水凝膠制備

1.3.1 SA 水凝膠的制備 用MES 緩沖液(pH=5)配制2%(w/v)SA 溶液，攪拌過(guò)夜至澄清。取10 mL SA溶液，加入191 μL 離子交聯(lián)劑0.75 mol/L 的CaSO4混勻，靜置成膠。

1.3.2 海藻酸鈉/殼聚糖/聚丙烯酰胺(sodium alginate/chitosan/polyacrylamide,SCM)復(fù)合水凝膠的制備 用MES 緩沖液(pH=5)配制2%(w/v)SA、2%(w/v)殼聚糖混合溶液，攪拌過(guò)夜至澄清，再加入4%(w/v)丙烯酰胺，攪拌混勻。取10 mL SA、殼聚糖、丙烯酰胺混合溶液，加入縮合劑NHS、EDC 各120 mg，充分?jǐn)嚢杌靹颉Ｔ僖来渭尤?2 μL 共價(jià)交聯(lián)劑2%MBAA，3 μL 促凝劑TEMED，75 μL 引發(fā)劑0.27 mol/L 的APS，191 μL 離子交聯(lián)劑0.75 mol/L 的CaSO4混勻，靜置成膠。

1.4 細(xì)胞3D 培養(yǎng) 將L929 細(xì)胞以1×106/mL 的密度包裹在水凝膠中，培養(yǎng)1、2、3 d 后進(jìn)行活死細(xì)胞染色。將細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，按1∶1 比例加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基和活死細(xì)胞染料工作液，室溫孵育30～45 min，然后使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察活/死細(xì)胞，綠色為鈣黃綠素標(biāo)記的活細(xì)胞，紅色為乙錠標(biāo)記的死細(xì)胞。活死細(xì)胞染料工作液配制：10 mL PBS+5 μL Component A +20 μL Component B。

1.5 水凝膠的抗菌測(cè)定 在48 孔板中成膠，將孔板中的水凝膠浸泡并用滅菌的ddH2O 泡洗24 h，每4 h 更新一次無(wú)菌水以除去細(xì)菌。將10 μL 細(xì)菌懸浮液(106CFU/mL)鋪展于水凝膠表面，并將接種后的水凝膠在37 ℃生化培養(yǎng)箱孵育4 h。孵育后，用1 mL無(wú)菌PBS 加到每個(gè)孔中以重懸所有存活的細(xì)菌，將10 μL 細(xì)菌懸浮液(106CFU/mL)溶于1 mL PBS 中作為陰性對(duì)照。取100 μL 稀釋菌液涂布平板，在37 ℃下孵育約16 h 后測(cè)定菌落數(shù)。每組重復(fù)測(cè)試3 次，結(jié)果表示為細(xì)菌殺死率，細(xì)菌殺死率/%=(對(duì)照組細(xì)菌菌落數(shù)-水凝膠上存活的細(xì)菌菌落數(shù))/對(duì)照組細(xì)菌菌落數(shù)×100。

1.6 體內(nèi)降解 根據(jù)南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)指南處理所有動(dòng)物。參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T1688)，采用成年雌性新西蘭白兔(2.5～3.0 kg)，通過(guò)兔子背部皮下植入評(píng)估水凝膠的體內(nèi)降解特性。切開(kāi)兔子背部皮膚(長(zhǎng)約1 cm)，制造一個(gè)外側(cè)皮下口袋，將水凝膠樣品(10 mm×3 mm×3 mm)在無(wú)菌條件下植入。手術(shù)后，允許兔子在單個(gè)籠子中自由移動(dòng)，并按標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)食物和水。在指定的時(shí)間(第1、2、3個(gè)月)處死新西蘭白兔，手術(shù)切除周?chē)M織，對(duì)樣品進(jìn)行體內(nèi)降解研究。水凝膠體內(nèi)降解率/%=(W0-Wt)/W0×100。W0：水凝膠植入前凍干質(zhì)量；Wt：水凝膠植入一定時(shí)間取出后的凍干質(zhì)量。

1.7 構(gòu)建傷口修復(fù)模型 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心審查并批準(zhǔn)。復(fù)合麻醉劑腹腔注射麻醉27 只健康的雄性SD 大鼠(180～250 g)，并背部剃毛，在每只大鼠的背部創(chuàng)建1 個(gè)圓形的全層傷口(約2 cm×2 cm)，然后將它們隨機(jī)分為A、B、C 組。A 組，用生理鹽水處理作為陰性對(duì)照；B 組，使用商業(yè)傷口敷料(主要成分SA 水凝膠)作為陽(yáng)性對(duì)照；C 組，用SCM 水凝膠處理傷口(先將預(yù)凝膠溶液引入缺損處以適合傷口，再室溫原位成膠)；D 組，用負(fù)載L929細(xì)胞的SCM 水凝膠處理傷口。水凝膠和生理鹽水的前體溶液通過(guò)使用200 nm 注射器式過(guò)濾器過(guò)濾而滅菌。手術(shù)后，將大鼠單獨(dú)關(guān)在籠子里，使其愈合，檢查傷口，并在第0、1、4、7 天拍照記錄并取材。

1.8 蘇木精和伊紅(H&E)染色 在第1、4、7 天，使用4%的多聚甲醛溶液灌注大鼠，收集傷口部位的樣品。將組織梯度脫水，制備冰凍切片；將切片轉(zhuǎn)移到裝有ddH2O 的染料罐中，泡洗3～5 min；蘇木精溶液染色20 min，用水洗滌；0.5%鹽酸分色3～10 s，自來(lái)水流水沖洗＞30 min，直到觀察到藍(lán)色；分別用50%、70%和80%乙醇處理樣品5 min，伊紅(由95%乙醇溶液稀釋)染色1 min；95%乙醇洗滌2 次、無(wú)水乙醇洗滌2 次，5 min/次；乙醇/二甲苯洗滌、二甲苯溶液洗滌3 次，5 min/次，完全脫水；中性樹(shù)膠封片，在通風(fēng)櫥中干燥；最后，使用正置顯微鏡觀察H&E 染色結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 5.0 軟件分析。結(jié)果以表示，兩組間比較采用兩尾未配對(duì)的T 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 水凝膠制備 成功制備了SA 水凝膠和SCM復(fù)合水凝膠，見(jiàn)圖1。Ca2+與海藻酸的側(cè)鏈共價(jià)鍵合；MBAA、TEMED 和APS 促進(jìn)丙烯酰胺交聯(lián)；而EDC和NHS 促進(jìn)了殼聚糖和海藻酸鹽之間酰胺鍵的形成。固化后的兩種水凝膠，具有良好的形態(tài)穩(wěn)定性，可以制備成特定形態(tài)。

圖1 水凝膠實(shí)物圖

2.2 細(xì)胞3D 培養(yǎng) 細(xì)胞在水凝膠中3D 培養(yǎng)1、2、3 d，進(jìn)行活死細(xì)胞染色(綠色熒光代表活細(xì)胞；紅色熒光代表死細(xì)胞)，共聚焦顯微鏡拍照觀察，見(jiàn)圖2。細(xì)胞能夠在兩種水凝膠中均能存活良好，3 d 時(shí)，只觀察到少量死細(xì)胞(紅色)。細(xì)胞存活率均>75%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 L929 細(xì)胞封裝于水凝膠1、2、3 d 后進(jìn)行活死細(xì)胞染色

圖3 L929 細(xì)胞封裝在兩種水凝膠中1、2、3 d 后的細(xì)胞存活率比較

2.3 抑菌特性 稀釋涂布平板結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SCM 水凝膠對(duì)大腸埃希菌(革蘭陰性細(xì)菌)和金黃色葡萄球菌(革蘭陽(yáng)性細(xì)菌)均具有良好的表面抗菌特性，而SA 水凝膠無(wú)明顯抑菌作用，見(jiàn)圖4。定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，SA 水凝膠對(duì)兩種菌的抑菌率均<25%。SCM 水凝膠組對(duì)兩種菌的抑菌率均>75%，SCM 水凝膠抑菌效果明顯優(yōu)于SA 水凝膠(P<0.001)，見(jiàn)圖5。

圖4 水凝膠培養(yǎng)大腸埃希菌/金黃色葡萄球菌稀釋涂布平板圖

圖5 水凝膠培養(yǎng)大腸埃希菌/金黃色葡萄球菌抑菌率統(tǒng)計(jì)圖

2.4 體內(nèi)降解 將SCM 水凝膠植入兔子背部皮下一定時(shí)間后觀察、取材，評(píng)價(jià)該水凝膠的體內(nèi)降解特性。SCM 水凝膠體積隨植入時(shí)間的增加而顯著減少，并且植入部位周?chē)鷽](méi)有顯著不良反應(yīng)，質(zhì)量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，水凝膠的降解率隨植入時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在植入3 個(gè)月后SCM 水凝膠可降解約50%，見(jiàn)圖6。

圖6 水凝膠體內(nèi)降解情況

2.5 傷口修復(fù) 使用生理鹽水(A 組)、商用敷料主要成分SA 水凝膠(B 組)、SCM 水凝膠組(C 組)和負(fù)載L929 細(xì)胞的SCM 水凝膠(D 組)修復(fù)大鼠背部傷口，觀察第0、1、4、7 天的傷口恢復(fù)情況，結(jié)果顯示C 組與D 組的背部創(chuàng)面愈合效果整體優(yōu)于A 組和B 組，見(jiàn)圖7。傷口大小恢復(fù)度定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與A 組和B 組對(duì)照相比，在第1 天和第4 天，C 組與D 組傷口恢復(fù)有明顯改善(P<0.01)；同時(shí)，在第4 天，D 組傷口恢復(fù)明顯優(yōu)于C 組(P<0.05)，而隨著時(shí)間的推移，在第7 天時(shí)所有組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖8。H&E 染色結(jié)果顯示，與B 組和C 組相比，D組中水凝膠與傷口周?chē)M織形成了緊密而無(wú)縫的界面，促進(jìn)了細(xì)胞從傷口周?chē)M織更快地遷移到水凝膠中，在第7 天時(shí)細(xì)胞完全浸潤(rùn)于水凝膠中，見(jiàn)圖9。

圖7 0、1、4、7 d 采集的大鼠背部傷口照片

圖9 SD 大鼠皮膚傷口中原位形成水凝膠的組織切片的H&E 染色圖像

3 討 論

皮膚創(chuàng)傷是最常見(jiàn)的組織損傷之一[15]。傷口的閉合及隨后的愈合會(huì)影響患者的身心狀況，因此提高傷口愈合的效率對(duì)患者自身和社會(huì)經(jīng)濟(jì)都具有重大意義[16]。而促進(jìn)傷口修復(fù)的關(guān)鍵在于如何簡(jiǎn)化傷口的愈合過(guò)程，加快傷口的閉合，以及防止傷口感染。因此，對(duì)理想傷口敷料的需求不斷增加[17]。

當(dāng)前傷口敷料的主要目的是粘合傷口，保持傷口部位的水分，促進(jìn)組織修復(fù)[18]。因此，本研究構(gòu)建了具有良好組織相容性的水凝膠敷料，聚丙烯酰胺與海藻酸鏈形成的互穿交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)使水凝膠具有更好的力學(xué)性能與形態(tài)穩(wěn)定性，有利于水凝膠適應(yīng)在體傷口修復(fù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。同時(shí)，添加氨基橋連聚合物-殼聚糖，利用氨基羧基縮合反應(yīng)形成共價(jià)鍵，可原位成膠以匹配各種形態(tài)的傷口，實(shí)現(xiàn)與受損組織邊緣的緊密粘合。

同時(shí)，傷口敷料應(yīng)具有良好的抑菌特性，避免傷口感染[19]。抑菌實(shí)驗(yàn)[20-21]顯示，SCM 水凝膠對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌具有顯著的抗菌活性，因?yàn)闅ぞ厶菐щ姷陌被軌蚱茐募?xì)菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)液釋放。另一方面，水凝膠對(duì)大腸埃希菌的抑制效果均比金黃色葡萄球菌低，這是因?yàn)榕c金黃色葡萄球菌相比，大腸埃希菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜[22]。實(shí)驗(yàn)表明，殼聚糖賦予了水凝膠出色的抗菌特性，有利于水凝膠的體內(nèi)應(yīng)用。

生物材料中細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)對(duì)于組織修復(fù)和再生至關(guān)重要[23]。而體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞都位于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中，細(xì)胞和ECM 一起形成復(fù)雜的三維(3D)架構(gòu)。由于2D 表面和ECM之間存在環(huán)境差異，2D 細(xì)胞培養(yǎng)通常無(wú)法反映體內(nèi)細(xì)胞的生理行為，在3D 培養(yǎng)的許多細(xì)胞類(lèi)型顯示出與2D 細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞行為不同的特定細(xì)胞行為(如黏附、遷移、形態(tài)發(fā)生、基因表達(dá)等)[24]。此外，研究[25]發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞可在損傷后生成皮膚膠原纖維，是促進(jìn)受損皮膚早期修復(fù)的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)證明了L929 成纖維細(xì)胞在3D 水凝膠支架中生長(zhǎng)良好，可用于細(xì)胞負(fù)載，并具有成為3D 培養(yǎng)基的潛力。同時(shí)，新西蘭白兔背部皮下植入實(shí)驗(yàn)顯示該水凝膠有著良好的體內(nèi)降解性，將適合于體內(nèi)應(yīng)用。

在全厚度皮膚缺損模型中進(jìn)一步評(píng)估了水凝膠負(fù)載成纖維細(xì)胞促進(jìn)傷口愈合的效果，結(jié)果顯示負(fù)載細(xì)胞的水凝膠在早期1、4 d 內(nèi)顯示出明顯的創(chuàng)面修復(fù)和皮膚再生優(yōu)勢(shì)，這歸因于殼聚糖固有的抗菌性能和止血性能[26-28]，以及水凝膠敷料提供的潮濕傷口環(huán)境[29]。同時(shí)，成纖維細(xì)胞是間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞，它們負(fù)責(zé)結(jié)締組織中大多數(shù)ECM 的產(chǎn)生，對(duì)不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損的修復(fù)有著十分重要的作用[30]。

綜上所述，負(fù)載細(xì)胞的抗菌多糖水凝膠可以有效地促進(jìn)傷口修復(fù)，但水凝膠中成纖維細(xì)胞對(duì)皮膚再生促進(jìn)作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究明確。