時 楊，賽文莉，黃海濤，吳廣洲，姚登福***

(1 南通大學第四附屬醫(yī)院胸外科，鹽城 224001；2 南通大學附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心；3 南通大學第二附屬醫(yī)院胸外科)

基礎及臨床資料[1-2]已證明實體腫瘤內(nèi)缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor,HIF)過表達，以調(diào)控下游血管生成相關因子活化，促新血管形成，在腫瘤進展過程中發(fā)揮重要作用。HIF 主要調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)，為生理或病理性低氧反應關鍵轉(zhuǎn)錄因子，常氧時抑癌基因VHL(von Hippel-Lidau)產(chǎn)物pVHL，為缺氧依賴性蛋白引導HIF-1α 多聚泛素化，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控細胞增殖、血管新生、激活多種缺氧反應基因表達，與腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移和預后等密切相關[3-4]。肺癌最主要的特征是癌細胞難以調(diào)控方式生長，過度增殖致組織耗氧量增加，激活缺氧反應性基因表達，誘導新血管生成，提供氧氣滿足癌細胞能量代謝和轉(zhuǎn)移等[5]。然而，肺癌組織中HIF-1α 的表達情況及其調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的作用機制尚不清楚。本文以組織芯片(tissue microarray,TMA)和免疫組織化學法分析肺癌組織中HIF-1α 和VEGF 表達、細胞定位及與臨床病理特征的關系；并構建靶向HIF-1α 基因轉(zhuǎn)錄的干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌細胞，觀察對下游VEGF 的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 肺癌組織 收集南通大學第四附屬醫(yī)院在2017 年1 月—2018 年12 月間住院肺腺癌患者術后癌和非癌組織標本各60 份，男38 例，女22 例；年齡26～76 歲，其中≤60 歲19 例，>60 歲41 例。所有組織均按肺癌病理織學(H&E 染色)檢查證實為腺癌，均有完整住院記錄和隨訪資料，符合肺癌診療規(guī)范，按肺癌標準核實診斷。本研究經(jīng)南通大學第四附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 肺癌細胞株 肺BEAS-2B 細胞、肺癌SPC-A-1、NCI-H1650、A549 和NCI-H1975 細胞均購自中國科學院上海細胞所。經(jīng)篩選HIF-1α 高表達株后，將癌細胞設空白對照組(空白組)、陰性對照組(mRNAineg 組,陰性組)和HIF-1α mRNA 干擾組(mRNAi組,干擾組)進行研究。

1.3 TMA 肺腺癌患者術后癌及非癌組織蠟塊依據(jù)病理學檢查于石蠟切片上標記，以TMA 機細針打孔法在涂多聚賴氨酸載玻片上制作圓柱形、整齊排列的TMA，孔徑1.5 mm，芯間距0.2 mm，芯片于塑料盒固定55 ℃10 min，蠟溶解前取出冷卻，4 ℃保存。切片前夾在切片機上修正組織，-20 ℃冰袋貼蠟塊5 min，4 μm 切片于涼水展開后，移至45 ℃水浴2 min，貼片60 ℃，3 min，58 ℃18 h，-20 ℃保存。

1.4 免疫組織化學染色 TMA、水化、雙氧水阻斷、高壓加熱法修復抗原和動物血清封閉。采用武漢博士德生物工程有限公司的免疫組織化學分析試劑盒分析肺癌及非癌組織HIF-1α 或VEGF 表達。兔抗人VEGF(1∶1 000)或HIF-1α 抗體(1∶500,英國Neo－Markers 公司)于4 ℃過夜，加0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)(pH=7.5)洗滌后，加生物素標記二抗，置室溫10 min 后以PBS 洗滌，加鏈霉素抗生物素蛋白/過氧化酶，室溫10 min，PBS洗滌；加新配制四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色，水洗，蘇木精復染，無水乙醇脫水、封片。于光學顯微鏡下觀察，攝片。以0.01 mol/L PBS(pH=7.5)替代第一、第二抗體作為對照。以棕黃色或棕褐色的HIF-1α或VEGF 表達，任選5 個高倍視野(400×)/片計數(shù)陽性細胞，按陽性細胞所占比例分為<10%、10%～25%、>25%～50%和>50%；強度分別為陰性(-)、弱陽性(+)、中等陽性(++)和強陽性(+++)。

1.5 干擾質(zhì)粒構建 按HIF-1α mRNA 序列(NM_001530)[6]以Invitrogen miRNA 軟件設計4 對短發(fā)夾RNA 寡聚單鏈DNA，從中篩選出一對最有效序 列：5′-TGCTGTAAAGCATCAGGTTCCTTCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGAAGGACTGATGCTT -TA-3′和5′-CCTGTAAAGCATCAGTCCTTCTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAAGAAGGAACCTGATGC -TTTAC-3′，其中劃線部分為靶區(qū)序列，上下游為莖環(huán)結(jié)構。按照BLOCK-iTTMPolII-miR RNAi 表達載體試劑盒(Invitrogen,上海)操作，將HIF-1α mRNAioligo 插入pcDNATM6.2-GW/EmGFP 表達載體，以不含干擾序列pcDNATM6.2-GW/EmGFP 作為陰性對照。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染與干擾效率 肺Beas-2B 細胞，肺癌SPCA-1、NCI-H1650、A549 和NCI-H1975 細胞復蘇，以RPMI 1640 培養(yǎng)基(南京凱基及美國Corning公司)，CO2及100%濕度培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞設干擾、陰性和空白組；各組分別加靶向HIF-1α 干擾質(zhì)粒、陰性質(zhì)粒、空白對照及FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h 每孔加2 mL 細胞懸液，加轉(zhuǎn)染試劑和干擾載體與轉(zhuǎn)染試劑形成復合物，培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后24、48 和72 h，將A549 細胞(5×105)接種，加無抗生素培養(yǎng)基24 h 后細胞密度至全孔80%；將干擾或陰性組RPMI 1640 稀釋6 μL Engreen 轉(zhuǎn)染試劑(北京英格恩生物科技有限公司)混勻，室溫5 min，將干擾和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549 細胞，設空白對照，24 h 后熒光顯微鏡觀察效率。HIF-1α mRNA 以QuickGene 試劑在FUJIFILM 核酸儀制備后，以ReverAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas,美國)合成cDNA，以引物5′-CCACTGCCACCACTGATGAA-3′(nt 2 254～2 273)和5′-TTGGTGAGGCTGTCCGACTT-3′(nt 2 412～2 431)終產(chǎn)物為178 bp；β-actin 為內(nèi)參，其引物序列為：5′-ATTGCCGACAGGATGCAGA-3′和5′-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′，置Roche LightCycler480ⅡPCR 儀中，在95 ℃5 min 預變性后，以95 ℃10 s；60 ℃30 s；72 ℃30 s，循環(huán)40 次，4 ℃保存。計算相對干擾效率=2-△△Ct。

1.7 細胞增殖分析 干擾、陰性和空白組細胞以細胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)(日本同仁化學研究所)分析法，在轉(zhuǎn)染開始0、24、48、72 h 分析細胞增殖(n=5)，于多功能酶標儀測吸光度(A450)，計算均值。

1.8 細胞遷移分析 將細胞消化、離心后，以1×105個/孔細胞重懸于100 μL RPMI 1640 培養(yǎng)基中，加入Transwell 小室的上腔室，下腔室中加入600 μL含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)培養(yǎng)基孵育12 h。之后4%多聚甲醛固定遷移到小室下表面細胞以結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡攝片，每室隨機選擇5 個視野并對染色細胞進行計數(shù)(n=5)。

1.9 細胞侵襲分析 將基質(zhì)膠和RPMI 1640 培養(yǎng)基按1∶20 混勻，每孔50 μL 包被Transwell 小室底部膜的內(nèi)室面。之后將1×105個/孔細胞重懸于100 μL無血清培養(yǎng)基中，加入Transwell 小室上腔室，下腔室中加入600 μL 含10%FBS 的培養(yǎng)基孵育48 h。4%多聚甲醛固定遷移到小室下表面細胞以結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡拍攝染色的細胞，每室隨機選擇5個視野并對染色細胞進行計數(shù)(n=5)。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析 以ELISA 法定量檢測細胞培養(yǎng)液中HIF-1α 和VEGF 濃度，按HIF-1α 和VEGF 檢測試劑盒(ADL,美國)使用說明書進行測定。以標準液制備檢測標準曲線，分設標準、待測和空白孔，標準孔加系列濃度標準品，空白孔加空白對照液，待測孔加細胞培養(yǎng)上清液，酶標板加覆膜，于37 ℃2 h 后棄液體，加檢測溶液A 后加膜，37 ℃1 h 后棄液體，洗液浸2 min 棄液體，加檢測溶液B覆膜，37 ℃30 min，棄液，加顯色液覆膜37 ℃，加終止液后測吸光度(A450)，依據(jù)標準曲線，計算HIF-1α和VEGF 濃度。

1.11 免疫印跡分析 從細胞中制備蛋白，以上海碧云天生物技術公司的BCA 試劑檢測蛋白濃度，制備十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠，蛋白經(jīng)SDS 處理與上樣緩沖液(Biosharp 公司,上海)混勻，加樣在PAGE 中恒壓80 V×35 min 后100 V×60 min 電泳結(jié)束后，取出凝膠轉(zhuǎn)膜，加鼠抗人HIF-1α(1∶500,Abbkine,美國)，4 ℃過夜，漂洗，加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 抗體(1∶1 000,Abbkine,美國)二抗孵育2 h，漂洗、增強化學發(fā)光法顯色并攝像。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組織HIF-1α 和VEGF 表達的免疫組織化學分析 構建癌或非癌TMA，點陣排列整齊，無掉片、移位，無扭曲。經(jīng)免疫組織化學分析，肺癌及非癌組織HIF-1α 呈棕黃色顆粒狀，定位胞質(zhì)和細胞核，癌灶組織中表達均勻，壞死區(qū)及浸潤區(qū)的邊緣見HIF-1α 呈增強表達(圖1A)，癌邊緣組織明顯增加，其強度高于對照的非癌組織(圖1B)。肺癌及非癌組織VEGF 表達呈棕褐色，胞質(zhì)和胞核中表達均勻(圖1C)，非癌組織VEGF 顯色較淡，癌組織VEGF 表達強度高于對照非癌組織(圖1D)。肺癌組HIF-1α 陽性率為88.3%(53/60)，顯著高于自身對照非癌組的10.0%(6/60)(χ2=70.553,P<0.001)；癌組織中/強陽性表達(++～+++)占83.3%，非癌組織陰/弱陽性表達(-～+)占93.3%；肺癌組VEGF 陽性率90.0%(54/60) 顯著高于非癌組的13.3%(8/60)(χ2=67.575,P<0.001)，癌組織中/強陽性表達占86.7%，非癌組織陰/弱陽性表達占91.7%。

圖1 肺癌及非癌組HIF-1α 和VEGF 表達的免疫組織化學分析(400×)

2.2 肺癌組織HIF-1α 和VEGF 表達的臨床病理學特征 肺癌組織HIF-1α 和VEGF 表達的主要臨床特征見表1。在60 例癌組織HIF-1α 和VEGF 陽性表達與肺癌TNM 分期高、分化程度差、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移等顯著相關(P<0.05)。

表1 肺癌組織HIF-1α 與VEGF 表達的臨床病理學特征(n=60)

2.3 肺癌細胞HIF-1α 的表達 HIF-1α 在肺Beas-2B 細胞及肺癌SPCA-1、NCI-H1650、A549 和NCI-H1975 細胞的表達水平見圖2。培養(yǎng)的細胞生長良好，以Western Blot 法分析不同細胞株中HIF-1α 表達(圖2A)；各細胞株HIF-1α/β-actin 比率(圖2B)及HIF-1α mRNA 差異(圖2C)，顯示肺Beas-2B細胞HIF-1α 表達量最少，肺癌SPCA-1 和NCIH1650 細胞HIF-1α 中等表達；肺癌A549 及NCIH1975 細胞HIF-1α 過表達。本文將A549 細胞用于后續(xù)研究。

圖2 不同肺癌細胞中HIF-1α 的表達

2.4 干擾HIF-1α 轉(zhuǎn)錄對VEGF 的調(diào)控作用 構建特異的HIF-1α mRNA 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549 細胞后，對HIF-1α 基因轉(zhuǎn)錄、蛋白及下游VEGF 影響見圖3。干擾HIF-1α 基因(圖3C)影響癌細胞增殖，明顯高于空白組(圖3A)和陰性對照組(圖3B)；免疫印跡法證實干擾組HIF-1α 顯著抑制(圖3D)，轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后，HIF-1α mRNA(2-△△Ct,圖3E)抑制率分別為13.2%(P=0.007)、60.8%(P<0.001)、87.1%(P<0.001)；且培養(yǎng)液中VEGF 減少，分別抑制25.4%(P<0.01)，45.8%(P<0.001)、54.3%(P<0.001,圖3F)。

圖3 干擾肺癌A549 細胞HIF-1α 轉(zhuǎn)錄對VEGF 表達的影響

2.5 HIF-1α 轉(zhuǎn)錄干擾影響肺癌細胞的生物學功能干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549 細胞后顯著影響癌細胞的增殖(圖4A)，干預組細胞增殖(圖4B)明顯低于陰性對照組(圖4C)和空白組(圖4D)，隨著時間延長，效果越明顯。干擾HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄影響A549 細胞侵襲和遷移能力(表2)。與空白組相比，干擾組侵襲和遷移細胞數(shù)明顯減少。

表2 干預HIF-1α mRNA 影響肺癌A549 細胞侵襲和遷移能力(，n=5)

表2 干預HIF-1α mRNA 影響肺癌A549 細胞侵襲和遷移能力(，n=5)

圖4 干擾HIF-1α mRNA 轉(zhuǎn)錄影響A549 細胞的增殖能力

3 討 論

肺癌是最常見的惡性腫瘤以及癌癥相關死亡的主要原因，患者早期癥狀不明顯，診斷難，預后差。肺癌仍以手術為主，放、化療為輔的綜合治療，但因癌細胞轉(zhuǎn)移和耐藥等原因，其療效欠佳，尋找新靶點和改進治療策略倍受關注[7-8]。肺癌的發(fā)生發(fā)展涉及原癌基因激活、抑癌基因失活以及凋亡相關基因異常，機制復雜[1]。HIF-1α 是HIF-1 的特異性活性調(diào)節(jié)亞基，常氧時HIF-1α 合成與降解維持穩(wěn)定，低于檢出極限；在缺氧的微環(huán)境中，肺癌相關基因表達調(diào)控靶基因的異常轉(zhuǎn)錄，HIF-1α 活化產(chǎn)生大量促血管生成因子誘導腫瘤新血管生成，使癌細胞生長獲得更多氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，同時癌細胞也更具侵襲性而影響患者的放、化療[2-3]。本文通過分析肺癌組織HIF-1α 和VEGF 表達及相互關系，并靶向A549 細胞HIF-1α mRNA 轉(zhuǎn)錄，初步探討了HIF-1α 對肺癌新血管形成的調(diào)控作用。

肺癌組織代謝旺盛，在缺氧狀態(tài)下HIF-1α 異?；罨c下游的缺氧反應元素結(jié)合加速新血管生成，以滿足癌細胞的生長需求，利于肺癌細胞浸潤、轉(zhuǎn)移，使癌細胞更具侵襲性。對人肺癌組織的免疫組織化學分析，顯示癌組織HIF-1α 呈棕黃色過表達，中等及強陽性表達病例＞80%，非癌組織＜7%。同時癌組織VEGF 中/強陽性表達＞86%，非癌組約9%。肺癌組織HIF-1α 和VEGF 均呈過表達，與患者瘤體大、腫瘤分化程度差、伴有淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移等，組間差異有統(tǒng)計學意義；與TNM 分期、瘤體大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或伴有遠處轉(zhuǎn)移、分化程度差等顯著相關，表明肺癌組織微環(huán)境氧濃度嚴重低下，誘發(fā)HIF-1α加速活化，以利于肺癌生長與轉(zhuǎn)移[9-10]。

分子靶向藥物的臨床使用已改善了肺癌的治療，但在很大程度上僅僅局限于攜帶特定的基因突變子集，靶向新血管生成在實體腫瘤的治療技術研發(fā)更有吸引力、更普遍[11-12]。在一線及二線治療中，使用抗VEGF 貝伐單抗或抗血管內(nèi)皮生長因子受體雷莫蘆單抗與化療聯(lián)合均可延長總生存期。靶向血管生成是有效的，但血管生成潛在信號通路多，加之肺癌異質(zhì)性抗血管生成的療效有限[13-15]。尋找針對肺癌新血管生成分子靶標，從分子水平逆轉(zhuǎn)血管重建，可抑制肺癌的生長與轉(zhuǎn)移。在多株肺癌細胞中均見HIF-1α 高表達，以特異性短發(fā)夾核酸干擾A548 細胞中HIF-1α mRNA 轉(zhuǎn)錄，顯示可顯著下調(diào)VEGF 的表達并可明顯降低癌細胞增殖、侵襲和遷移能力。提示干預癌細胞HIF-1α 基因轉(zhuǎn)錄，既可調(diào)控下游VEGF表達，也可抑制癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移等生物學行為。

綜上所述，肺癌仍是最常見的惡性腫瘤，在多病因及多中心的不斷發(fā)展過程中，組織低氧狀態(tài)下HIF-1α 的異常活化起重要作用。肺癌組織及細胞HIF-1α 和VEGF 過表達，以特異性干擾HIF-1α mRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549 細胞，既可阻斷肺癌生長或轉(zhuǎn)移的營養(yǎng)和氧氣供給，有效抑制癌細胞增殖，又可下調(diào)VEGF 表達降低癌細胞的侵襲、遷移能力，提示靶向HIF-1α 基因轉(zhuǎn)錄有望成為肺癌治療的潛在靶標，為研發(fā)新靶向治療技術提供實驗依據(jù)。然而靶向HIF-1α mRNA 治療及聯(lián)合抗血管生成藥物[16]，尚需要更多基礎及臨床驗證。