石桃雄 黎瑞源 潘凡 黃娟 朱麗偉 汪燕 梁成剛

摘要：【目的】開展苦養(yǎng)籽粒總黃酮含量與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，挖掘與黃酮含量相關(guān)的分子標(biāo)記，為高黃酮含量苦蕎品種的遺傳改良提供依據(jù)?！痉椒ā恳?93份苦蕎種質(zhì)為供試材料，基于62對SSR引物分析了供試種質(zhì)的遺傳多樣性，對總黃酮含量和SSR標(biāo)記進行了關(guān)聯(lián)分析。【結(jié)果】193個種質(zhì)籽?？傸S酮含量的變幅為1.04%- 2.99%，變異系數(shù)為27.93%。62對引物在193個種質(zhì)中共擴增出267個等位基因，每個SSR位點平均檢測到245個有效等位基因，基因多樣性為0 503，Shannon信息指數(shù)為0 942，觀測雜合度為0.513，引物多態(tài)信息量為0.74。群體結(jié)構(gòu)分析將193份種質(zhì)劃分為3個亞群?；趶V義線性模型（ GIM）共檢測到5個與籽?？傸S酮含量顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，表型貢獻率為6.3%- 12.9%，其中標(biāo)記TatG0124（ 12.9%）和S6853（ 8.5%）的表型貢獻率較高?！窘Y(jié)論】供試苦蕎種質(zhì)遺傳多樣性豐富，可用于苦蕎重要農(nóng)藝和品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析。TatG0124和SSR6853可能是控制籽粒黃酮含量的重要位點，對改良苦蕎籽粒黃酮含量具有重要意義。關(guān)鍵詞：苦蕎;SSR標(biāo)記;黃酮含量;遺傳多樣性;群體結(jié)構(gòu);關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號：S 517

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 08088408

Correlation Between Flavonoids Content and

SSR Markers of Tartary Buckwheat

SHI Taoxiong. LI Ruiyuan. PAN Fan， HUANG Juan. ZHU Liwei. WANG Yan. LIANG Chenggang*

（ Buckwheat Industry Technology Research Center. Guizhou Normal Universily， Guiyang， Guizhou 55000I . China ）

Abstract： 【Objective】 Correlation between the flavonoids content and associated markers was analyzed for geneticimprovement studies on Tartary buckwheat. 【Method】Sixty-two SSR primer pairs were used to assess the genetic diversityof 193 Tartary buckwheat germplasms. The SSR markers closely related to the total flavonoids content were selected byassociation analysis. 【Result】The total flavonoids content of 193 Tartary buckwheat germplasms varied from l.04% to2.gg% with a coefficient variation of 27.93%. Sixty-two pairs of SSR primers amplified 267 polymorphic sites with an averagenumber of effective alleles of 2.45. The mean values of gene diversity， Shannon index. observed heterozygosity andpolymorphism information content of SSR markers were 0.503. 0.942. 0.5 13 and 0.74. respectively. The population structureanalysis divided the 193 germplasms int0 3 subgroups. Five SSR markers were determined to be significantly associated withflavonoids content by the general linear model （GLM）. The phenotypic variations ranged from 6.3% t0 12.9% with TatG0124at 12.9% and S6853 at 8.5% being the higher markers. 【Conclusion】The germplasms used in this study were diverse ingenetic variation and feasible for related genome-wide mapping on important traits of Tartary buckwheat. The loci. TatG0124and S6853， appeared to closely associate with the flavonoids content of Tartary buckwheat and were considered to bepotentially useful for breeding new varieties with high content of the functional components.

Key words： Tartary buckwheat： SSR marker; flavonoids content; genetic diversity; population structure; correlation analysis

0 引言

【研究意義】苦蕎（Fagopyrum tataricum），又名韃靼蕎麥（ Tartary buckwheat），屬蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill）雙子葉植物，是蕎麥的兩大栽培品種之一[1]，廣泛種植于云、貴、川、藏等省區(qū)的高原和高寒地帶[2]?？嗍w是我國重要的雜糧作物之一，其籽粒含有豐富的多酚類化合物、抗性淀粉、可溶性纖維、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素及微量元素等，可有效地預(yù)防和改善肥胖、膽結(jié)石和心血管等疾病[3-4]，在食品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。黃酮類化合物屬多酚類物質(zhì)，苦蕎黃酮類化合物含量和種類豐富，生物活性獨特，是苦蕎保健功能最突出的一類生物活性物質(zhì)，對腫瘤、“三高”（高血脂、高血壓，高血糖）和炎癥等都有一定的輔助治療作用[3-4]。因此，研究苦蕎籽粒黃酮含量的遺傳機制，挖掘與之緊密連鎖的分子標(biāo)記，對苦蕎高黃酮含量專用型品種的選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前國內(nèi)外學(xué)者對蕎麥黃酮類化合物的研究主要集中在其含量和組分的遺傳變異評價[5-9]、生物合成調(diào)控機理揭示及代謝途徑上一些關(guān)鍵基因的挖掘與鑒定[10]等方面?？嗍w種質(zhì)資源中黃酮含量變異豐富，表現(xiàn)出數(shù)量性狀遺傳的特點‘69]，所以傳統(tǒng)育種方法很難短期改良苦蕎品種的黃酮含量。目前苦蕎數(shù)量性狀基因座（ QTL）定位還處于遺傳群體和圖譜的構(gòu)建階段[ll]，還沒有和黃酮含量關(guān)聯(lián)的QTL或分子標(biāo)記的報道。關(guān)聯(lián)分析是解析數(shù)量性狀、挖掘有利等位基因、開發(fā)與目標(biāo)性狀緊密連鎖分子標(biāo)記的有效手段，在作物遺傳育種中發(fā)揮著重要作用。近年來，隨著苦蕎參考基因組的公布[12]，Zhang等[13]1對510份苦蕎種質(zhì)黃酮含量和重要農(nóng)藝性狀進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，推測FtUFGT3和FtAP2 YT1可能分別是調(diào)控籽粒黃酮含量積累和粒重的關(guān)鍵基因。【本研究切入點】SSR標(biāo)記是關(guān)聯(lián)分析常用的分子標(biāo)記之一。隨著測序技術(shù)的發(fā)展和測序成本的降低，蕎麥屬植物SSR標(biāo)記已被大規(guī)模開發(fā)[14-18]，主要用于苦蕎種質(zhì)資源遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)的研究[19-24]。但目前SSR標(biāo)記與苦蕎黃酮含量關(guān)聯(lián)分析的研究鮮有報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究調(diào)查了來自我國12個省區(qū)的193個苦蕎審定品種、地方品種和育種品系的籽?？傸S酮含量，利用SSR標(biāo)記關(guān)聯(lián)作圖法尋找可能與籽粒黃酮含量緊密連鎖的標(biāo)記，以期為分子標(biāo)記輔助選育高黃酮含量苦蕎品種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

搜集來自全國不同省區(qū)的審定品種、育種品系和地方品種等193個苦蕎種質(zhì)作為試驗材料，其中貴州139個、四川16個、云南13個、陜西7個、山西6個、江西2個，甘肅和湖南各3個，遼寧、內(nèi)蒙古、寧夏和西藏各1個。193個苦蕎資源由36個審定品種、75個地方品種和82個育種品系組成。

1.2田間種植

供試種質(zhì)于2016年種植于貴州師范大學(xué)柏楊試驗基地。每個種質(zhì)種植四行區(qū)，行長2.0 m，行間距為0.33 m，常規(guī)田間管理。籽粒成熟后，按小區(qū)收獲，脫粒、風(fēng)干至恒重。

1.3籽?？傸S酮含量的測定

稱取風(fēng)干后的飽滿籽粒30 9充分研磨，稱取0.1000 g粉末置于10 mL離心管中。采用75%的甲醇60℃恒溫水浴浸提，0.1 mol·L-l AIC13-1.0 mol·L-lKAc顯色，在波長420 nm處測定吸光度（新世紀(jì)T6紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和黃酮含量的具體測定過程參照呂丹等[8]的方法和步驟。

1.4 SSR基因型檢測和遺傳多樣性分析

在每份種質(zhì)種植小區(qū)中混合采集幼嫩葉片，采用植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根）提取DNA。對本課題組前期合成的350對SSR引物進行篩選，包含了150對Genic-SSR引物和200對Genomic-SSR引物，分別以“S”和“TatG”開頭命名，引物信息詳見黎瑞源等[25]的報道。PCR反應(yīng)體系為10 uL，包括：DNA模板（ 50ng·uL-l） 2.0 uL，2×Taq PCR MasterMix 5 uL，上下游引物（ 100 ng·uL-I）各0.5 uL，ddH20 2.0 uL。

PCR擴增產(chǎn)物在2000 V，80 W，100 mA/板的電泳條件下，采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳后，膠板用0.15% AgN03染色15min，1.5% NaOH顯影，具體步驟參考楊美[26]的試驗方法。膠板晾干后讀帶，將可重復(fù)的、清晰的條帶記為1，同一位置無帶或不易分辨的弱帶計為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。利用PowerMarker V3.25軟件計算每對引物擴增的等位基因數(shù)（ Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon信息指數(shù)（I）、觀察雜合度（Ho）和基因多樣性（He）及多態(tài)性信息量（ PIC）。

1.5群體結(jié)構(gòu)分析

利用STRUCTURE 2.2軟件對供試種質(zhì)SSR數(shù)據(jù)矩陣進行基于數(shù)學(xué)模型的亞群劃分。群體結(jié)構(gòu)K值設(shè)定為1～9，每個設(shè)定的K值進行10次獨立運算，Burn-in與MCMC周期均設(shè)定為100000次。將STRUCTURE 2.2軟件的運算結(jié)果先導(dǎo)入在線T具STRUCTURE HARVESTER（ http：//taylorO.biology.ucla.edu/structureHarvester/）計算統(tǒng)計值A(chǔ)K，確定最有可能的亞群數(shù);再導(dǎo)入在線工具CLUMPAK（ http：//clu-mpak.tau.ac.i1/）計算群體結(jié)構(gòu)。最后將計算結(jié)果導(dǎo)入到EXCEL 2019完成結(jié)果圖的繪制。

1.6黃酮含量與SSR分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

使用軟件TASSEL 3.0計算、繪制標(biāo)記連鎖不平衡（ LD）配對檢測的矩陣圖，觀測LD水平，Permutation設(shè)置1000次。使用該軟件的廣義線性模型（ GIM），將各個材料相應(yīng)的Q值作為協(xié)變量進行群體矯正，將黃酮含量與62個SSR標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)進行回歸分析，標(biāo)記與表型性狀的顯著性水平設(shè)定為p=0.05。TASSEL 3.0軟件中表型變異解釋率的計算公式為：R 2-SSM/SST，其中SSM為標(biāo)記基因型間平方和，SST為總平方和。

2 結(jié)果與分析

2.1苦蕎種質(zhì)SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析

利用從350對SSR引物中篩選到的多態(tài)性較好的62對引物，對193個苦蕎種質(zhì)進行擴增（圖1），共檢測H1 267個等位變異，每個SSR標(biāo)記平均檢測到4.31個等位基因（ Na），2.45個有效等位基因（Ne），范圍分別為3～9和1.02～7.28。觀測雜合度（Ho）平均為0.503，范圍為0～0.964。基因多樣性（He）平均為0 513，范圍為0.021～0.863。Shannon信息指數(shù)（I）平均為0.942，范圍為0.065～2.031。引物多態(tài)信息量（ PIC）平均為0.74，范圍為0.20—0.91。在62個SSR標(biāo)記中，有35.5%的標(biāo)記至少能檢測到5個以上等位基因，98.3%的標(biāo)記PIC> 0.5，64. 5%的標(biāo)記He> 0.5（表1），表明供試的193個苦蕎種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性。

2.2苦蕎種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)的分析

利用62個SSR標(biāo)記對供試種質(zhì)進行群體結(jié)構(gòu)分析，在K=3時，AK值最大（圖2），因此將193個苦蕎種質(zhì)劃分為3個亞群，命名為POPI、POP2和POP3（圖3），分別包含88、90和15個種質(zhì)。對各亞群的遺傳多樣性參數(shù)的統(tǒng)計可以看出，POPI是遺傳多樣性最豐富的亞群，平均每個SSR標(biāo)記檢測出4.21個Na，He為0.513，，為0.943。其次是POP2，平均每個SSR標(biāo)記檢測出3.74個Na，He為0.484，，為0.870（表2）。亞群POP2與POP3之間的Nei's遺傳距離最小，為0.026;POPI與POP3之間的Nei's遺傳距離最大，為0.076。3個亞群之間的成對Fst值平均為0.027;亞群POP2和POP3之間的成對固定系數(shù)Fst最小，為0.014;POPI和POP3之間的成對Fst值最大，為0.037（表3），表明劃分的3個亞群間遺傳分化程度低。

2.3連鎖不平衡分析

對62個SSR標(biāo)記形成的1891個成對組合進行連鎖不平衡（ LD）分析，整體共有644個組合存在顯著（P<0.05）的LD，占總組合數(shù)的34.1%，而三個亞群POP1、POP2和POP3中，存在顯著的LD成對標(biāo)記組合數(shù)分別只有90（4.8%）、206（ lO.9%）和97（5.1%）個（表4），遠(yuǎn)少于在全體種質(zhì)中檢測到的數(shù)目，表明群體結(jié)構(gòu)會影響連鎖不平衡的分析。

2.4黃酮含量的變異和關(guān)聯(lián)分析

193個苦蕎種質(zhì)籽粒黃酮含量平均為2.11%，變幅為1.04%～2.99%，變異系數(shù)為27.93%。偏度和峰度分別為0.29和1.17，說明籽粒黃酮含量呈近似的正態(tài)分布。以上結(jié)果表明，供試種質(zhì)籽粒黃酮含量的變異豐富，可以進行關(guān)聯(lián)分析。

對黃酮含量與62個SSR標(biāo)記進行基于群體結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)分析，檢測到5個與黃酮含量顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記（表5），共解釋43.30%的表型變異率。其中TatG0124解釋了12.g%的表型變異率，是5個位點中貢獻率最大的。其次是S6853，解釋了8.5%的表型變異率。

3討論與結(jié)論

群體具有豐富的遺傳和表型變異，且內(nèi)部沒有明顯的群體結(jié)構(gòu)是關(guān)聯(lián)分析成功的關(guān)鍵條件[27]。群體的遺傳多樣性與群體的大小、來源、標(biāo)記數(shù)量和引物的類型等因素有關(guān)。有效等位基因數(shù)目（ Ne）、期望雜合度/基因多樣性（He）、Shannon信息指數(shù)（I）和多態(tài)信息量（PIC）等參數(shù)能有效地度量和比較不同群體的遺傳多樣性。一般認(rèn)為He> 0.5，群體沒有高強度的選擇，擁有豐富的多態(tài)性，He< 0.5的群體遺傳多樣性低;PIC> 0.5的位點為高度多態(tài)座位[28]。本文利用62對SSR引物分析了193個苦蕎種質(zhì)遺傳多樣性，其，和PIC平均分別為0.942和0.74，高于山西地方品種（He和PIC的均值分別為0.4475和0. 3869）[29]、云南地方品種（He和PIC的均值分別為0.508和0.44）[20]、我國審定品種（PIC均值為0.44）[19]和國內(nèi)外苦蕎種質(zhì)（PIC均值為0.40）[16] SSR標(biāo)記的遺傳多樣性，說明本研究中的193個苦蕎種質(zhì)的遺傳多樣性豐富。62對SSR引物中11對來自苦蕎基因組序列，其Ne、I、He和PIC均值分別為3.837、1.427、0.707和0.855;51對來自苦蕎轉(zhuǎn)錄組序列，其Ne、I、He和PIC分別為2.154、0.837、0.471和0.719?？梢姡蚪MSSR位點的多態(tài)性程度要高于轉(zhuǎn)錄組SSR位點。62個引物中，有35.5%的引物至少能檢測到5個以上等位基因，98.3%的引物PIC>0.5，64.5%的引物He> 0.5，這些等位基因豐富、高度多態(tài)性的引物可有效地用于今后苦蕎種質(zhì)遺傳多樣性的研究。

群體結(jié)構(gòu)是指一個群體內(nèi)存在亞群的情況，群體結(jié)構(gòu)會增加染色體間的LD，造成目標(biāo)性狀和基因位點的偽關(guān)聯(lián)[27]。本研究利用群體結(jié)構(gòu)分析將193個供試苦蕎種質(zhì)劃分為3個亞群，亞群間的成對固定系數(shù)Fst為0.014～0.037，表明3個亞群間遺傳分化程度低。62個SSR標(biāo)記之間的LD分析顯示，三個亞群POPI、POP2和POP3間存在顯著的LD的標(biāo)記組合數(shù)分別有90、206和97個，數(shù)目遠(yuǎn)少于在全體材料中檢測到的644個，這表明通過群體結(jié)構(gòu)可對供試種質(zhì)進行有效的劃分，降低目標(biāo)性狀與標(biāo)記關(guān)聯(lián)的假陽性，提高關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確度。以上結(jié)果為利用該群體進行苦蕎重要性狀的關(guān)聯(lián)分析提供了重要參考。

本研究中193份苦蕎種質(zhì)籽?？傸S酮含量變幅為1 .04%～2.99%，變異系數(shù)為27.93%，黃酮含量的變異程度大于Gupta等[30]報道的印度喜馬拉雅地帶的195份苦蕎種質(zhì)和劉三才等[6]調(diào)查的來自我國四川、云南、貴州、寧夏、湖南和山西等地的76份苦蕎種質(zhì)籽?？傸S酮含量的變異程度，也大于呂丹等[8]和鄭冉等[9]報道的苦蕎遺傳群體籽?？傸S酮含量的變異程度。本研究對供試驗種質(zhì)籽粒黃酮含量與62個SSR標(biāo)記進行了基于群體結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)分析，定位到了5個與籽粒黃酮含量顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，共解釋43.3%的表型變異率。其中TatG124（ 12.9%）和SSR6853（ 8.5%）解釋的表型變異率較大，由此推測SSR0124和SSR6853是控制籽粒黃酮含量的重要位點，可進一步驗證開發(fā)為實用性標(biāo)記，將為分子標(biāo)記輔助選育高籽粒黃酮含量苦蕎品種提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：于洪杰）

收稿日期：2021-0425初稿;2021-0629修改稿

作者簡介：石桃雄（ 1980-），女，博士，副教授，研究方向：蕎麥種質(zhì)資源保育及創(chuàng)新（E-mail： shitaoxiong@126.com）：共同第作者：黎瑞源

（ 1980-），男，博士，副教授，研究方向：生物信息學(xué)（E-inail： ruiyuan li@126.coin）

*通信作者：粱成剛（ 1985-），男，博士，副教授，研究方向：蕎麥遺傳育種（E-mail： jesselcg@163.com）基金項目：圍家重點研發(fā)計劃項日（2019YFDl001300. 2019YFDl001301）：國家自然科學(xué)基金項日（31960125）：貴州省科技支撐計劃項日（黔科合ZC[2019]2298）;貴州省蕎麥種質(zhì)資源保育及創(chuàng)新重點實驗室建設(shè)基金項日（黔教合KY[2017]002）;貴州師范大學(xué)博士啟動基金項日（11904/0514027）