戰(zhàn)翔宇，孫玉鴻，陳 瑞，趙 陽，張東瑞，薛 嵩，劉 佳，隋洪玉

(1.佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最嚴重和常見的慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者的主要死因之一[1]，其早期病理改變主要為腎臟肥大。腎臟肥大是由于細胞的肥大和增生聯合所致，其機制涉及許多因素，諸如血流動力學、高血糖、細胞因子、氧化應激、代謝因素及某些特異基因表達等，其中細胞因子起著非常重要的作用[2,3]。研究顯示，TNF-α與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[4]，但它是否參與了DN中腎臟肥大的形成過程鮮有報道。本研究旨在探討TNF-α對糖尿病腎病大鼠腎臟肥大的影響，以期為糖尿病腎病的早期防治提供新的理論依據和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD (Sprague- Dawley)大鼠，體質量180～220g，由佳木斯大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗材料

鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)由Sigma公司提供，TNF-α抗體由Abcam公司提供，Actin-β由Affinity公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及處理

取32只SD雄性大鼠(200～250g)，適應性喂養(yǎng)1周，禁食10h后，隨機平均分成4組，分別為：正常組(NC，n=8)、糖尿病模型組(DM，n=8)、正常+TNF-α阻斷劑組(NC+TNFR:Fc，n=8)、糖尿病+TNF-α阻斷劑組(DM+TNFR:Fc，n=8)。DM組腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，60mg/kg)造模；NC組腹腔注射與DM組等量的檸檬酸緩沖液作為對照；NC+TNFR:Fc組腹腔注射與DM組等量的檸檬酸緩沖液，并在注射前一天皮下注射TNFR:Fc(2mg/kg)，以后按周2次注射TNFR:Fc至3周；DM+TNFR:Fc組腹腔注射STZ，并在注射STZ前一天皮下注射TNFR:Fc(2mg/kg)，以后按周2次注射TNFR:Fc至3周。

1.3.2 Western blot技術

取50μg蛋白樣品上樣后進行聚丙烯酰胺電泳，電泳結束后進行轉膜(200mA, 1h)，5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉1h后進行一抗孵育并4℃過夜，TBST溶液洗膜(4×10min)，室溫下二抗孵育1h，TBST溶液洗膜(4×10min)，ECL發(fā)光液顯影后進行凝膠成像分析。

1.3.3 ELISA技術

加入50μL標準品及檢測樣本至反應孔中，再加入50μL的相應抗體至所有孔，封板后室溫下孵育1h，洗液洗板3次后加入100μL 顯色底物至所有反應孔中并孵育10min，加入100μL停止液后立即用酶標儀450nm波長下測量OD值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 空腹血糖及24 h尿白蛋白變化

在實驗72h和3周時檢測大鼠空腹血糖，3周實驗結束時檢測24h尿白蛋白排泄量。結果顯示：與NC組相比，DM組空腹血糖明顯升高(P<0.01)；與NC組相比，DM組24 h尿白蛋白排泄量明顯升高(P<0.01)。結果表明糖尿病腎病模型制備成功。見表1。

表1 大鼠空腹血糖及24h尿白蛋白變化

2.2 腎組織中TNF-α蛋白表達變化

應用Western blot法檢測腎組織中TNF-α的蛋白表達,見圖1。結果顯示：與NC組相比，DM組腎組織中TNF-α的蛋白表達明顯升高(n=3,P<0.01)。

圖1 大鼠腎組織中TNF-α的蛋白表達

2.3 TNF-α對糖尿病大鼠腎臟肥大的影響

3周實驗結束時，立即取出大鼠雙側腎臟并稱重，通過腎濕重/體重計算腎指數。結果顯示：與NC組相比，DM組腎指數明顯升高(n=8,P<0.01)；與DM組相比，DM+TNFR:Fc組腎指數下降(P<0.05)。見表2。

表2 TNF-α對糖尿病大鼠腎指數的影響

3 討論

糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，已成為威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題之一。據統計，2019年全球約有4.63億糖尿病患者，中國糖尿病患者約為1.164億，位居世界首位，國際糖尿病聯合會預測2035年全球糖尿病患者人數將增至5.52億，這意味著每年將近增加一千萬新糖尿病患者。糖尿病引起的各種急慢性并發(fā)癥，致殘、致死率高，嚴重影響患者的生活質量及壽命，造成巨大的家庭和社會經濟負擔，而糖尿病腎病是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一，亦是誘發(fā)終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)最常見的原因，其已成為不可忽視的社會經濟問題[5]。

目前普遍認為DN是一種具有慢性、輕微等特征的“微炎癥”疾病[6,7]，主要表現為以巨噬細胞為主的炎癥細胞的激活以及各種與炎癥相關的炎性細胞因子在患者腎組織中的聚集。研究顯示，高血糖、脂質代謝異常及腎臟血流動力學的改變等均可刺激炎性細胞因子的產生，加重腎臟組織損傷，促進DN的發(fā)生與發(fā)展[8,9]。腫瘤壞死因子是一種具有多種生物活性的炎性細胞因子，包括TNF-α及TNF-β兩類。TNF-α主要由活化的單核細胞、巨噬細胞產生，也可由中性粒細胞、內皮細胞、平滑肌細胞產生。在腎臟，TNF-α主要是由系膜細胞、腎小管上皮細胞等產生。TNF-α與眾多炎性因子共同參與到DN形成的病理過程中，在DN的發(fā)病機制中擔當重要角色。TNF-α可直接對腎臟細胞造成細胞毒性，誘發(fā)腎損傷、凋亡和細胞壞死等；TNF-α可提高系膜細胞單核細胞趨化蛋白的分泌、聚集，刺激腎小球細胞增殖；還可誘導腎臟系膜細胞產ROS，改變腎小球血管壁的形態(tài)和結構，增加濾過膜的通透性，產生蛋白尿，但是否參與到DN腎臟肥大的形成中尚未明確。本實驗采用Western blot等技術觀察了糖尿病腎病大鼠模型腎組織中TNF-α的蛋白表達，以及TNF-α對腎指數的影響，結果顯示，DN大鼠腎組織TNF-α蛋白水平及腎指數顯著上升，而給予其阻斷劑后腎指數下降，說明TNF-α促進了糖尿病大鼠腎臟肥大的形成，但其形成機制尚需探討，在以后的實驗研究中將進一步尋找TNF-α促進腎臟肥大是通過何種信號轉導通路實現的。本實驗結果為探明TNF-α對糖尿病性腎臟肥大形成機制積累了一定的理論依據，亦為DN的靶向治療提供了新的作用靶點。