何 超，張 雪， 劉 爽

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

頭頸鱗癌包括頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤以及口腔頜面部腫瘤三大部分，發(fā)病率較高的為口腔鱗癌、鼻咽癌、喉癌。超過90%的頭頸部腫瘤為鱗狀細(xì)胞癌。最近10年全球頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率明顯上升，全球每年約有645，000例新發(fā)生的頭頸部癌病例[1，2]。在大多數(shù)國家，頭頸部腫瘤男性多于女性，且年齡≥50歲者多見。頭頸鱗癌發(fā)病隱匿，且容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，手術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，5年生存率不足50%[3]。TCGA數(shù)據(jù)庫是由美國國家癌癥研究所與美國國家人類基因組研究所合作建立的癌癥研究項(xiàng)目，匯總了癌癥相關(guān)的各種組學(xué)數(shù)據(jù)，是目前世界最大的癌癥研究參考數(shù)據(jù)庫。TCGA數(shù)據(jù)庫免費(fèi)提供33種癌癥的DNA、RNA、miRNA測(cè)序結(jié)果以及SNP、甲基化測(cè)序等多維度數(shù)據(jù)，通過這些信息幫助各國研究者分析癌癥特異性表達(dá)的基因[4]。我們課題組使用GEPIA在線軟件對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫分析頭頸鱗癌特異性基因，并在細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證，為頭頸鱗癌特異性生物標(biāo)志物的尋找提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取及差異分析

通過GEPIA在線軟件進(jìn)行泛癌分析COL3A1在31種癌癥中表達(dá)差異，進(jìn)而分析COL3A1在頭頸鱗癌人群與正常人群中表達(dá)水平，以及在頭頸鱗癌不同階段表達(dá)情況。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

正?？谇怀衫w維細(xì)胞株hMOF,口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株KB與CAL-27,由口腔醫(yī)院關(guān)鍵教授惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，TRIZOL試劑(購自碧云天生物公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑MightyScript 第一鏈 cDNA 合成Master Mix，熒光定量SYBR-qPCR Kit擴(kuò)增試劑盒(購自上海生工生物公司)。

1.3 細(xì)胞株中COL3A1表達(dá)水平檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，收集指數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)0.25%胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)，PBS洗滌離心，Trizol法提取總RNA。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)COL3A1

使用生工RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反應(yīng)溫度為：25℃5min；42℃30min；85℃5min。按生工熒光定量PCR試劑盒(染料法)說明書推薦進(jìn)行。COL3A1引物序列為：上游引物：5`-TCAGGCCAGTGGAAATGRAAAGA -3`,下游引物：5`-CACAGCCTTGCGTGTTCGATA -3`； TGF-β3引物序列為：上游引物：5`-CTCTACATTGACTTCCGACA -3`，下游引物：5`-GCAGATGCTTCAGGGTTC -3`。采用β-actin作為內(nèi)參，引物序列為：上游引物：5`-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC -3`,下游引物：5-`ATGGAGCCACCGATCCACA -3`。反應(yīng)體系：2Xmirna qPCR master mix 10μL；上下游引物各0.5μL；cDNA 2μL；ROX Reference Dye(H)1μL；RNase-free water 6μL；應(yīng)用7300 real time PCR進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件為：95℃150s；(95℃15s +60℃30s)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；溶解曲線以7300 real time PCR儀推薦的程序自動(dòng)設(shè)定。每份樣本均在同等條件下進(jìn)行COL3A1的檢測(cè)，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)。濃度相對(duì)水平進(jìn)行對(duì)數(shù)( 2^-△△CT) 處理后，比較COL3A1基因的起始模板量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 COL3A1在泛癌中的表達(dá)水平

對(duì)于頭頸鱗癌，TCGA數(shù)據(jù)庫包含519例腫瘤患者與44名正常對(duì)照者的總RNA表達(dá)信息。使用GEPIA在線分析，得到COL3A1,COL5A1，COL5A2,COL1A1,COL1A2，ADAM12以及COL12A1等差異表達(dá)基因，其中COL3A1差異最顯著，以此為切入點(diǎn)，進(jìn)行泛癌分析，發(fā)現(xiàn)在31種癌癥中，COL3A1在乳腺浸潤癌BRCA，食管癌ESCA,惡性膠質(zhì)瘤GBM,頭頸鱗癌HNSC,胰腺癌PAAD,胸腺瘤THYM等13種癌癥中高表達(dá)并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 COL3A1在不同癌癥與正常對(duì)照組織中表達(dá)

2.2 COL3A1在頭頸鱗癌中的表達(dá)水平

TCGA數(shù)據(jù)庫收集頭頸鱗癌患者519例，正常對(duì)照44例，通過RT-qPCR檢測(cè)mRNA水平，箱式圖及TPM圖可以明確COL3A1在頭頸鱗癌組織中高表達(dá)并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖2 COL3A1在頭頸鱗癌與正常對(duì)照組織中表達(dá)

在頭頸鱗癌發(fā)展的不同階段，可以看到COL3A1的表達(dá)水平的中位數(shù)變化不明顯，但變化范圍增加。見圖3。

圖3 COL3A1在頭頸鱗癌不同時(shí)期表達(dá)

2.3 COL3A1在頭頸鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平

從正常口腔成纖維細(xì)胞株hMOF與頭頸鱗癌細(xì)胞株KB，CAL中提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過染料法檢測(cè)COL3A1表達(dá)水平，RT-qPCR結(jié)果顯示，COL3A1在腫瘤細(xì)胞株中高表達(dá)，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 COL3A1及TGF-β1在頭頸鱗癌細(xì)胞株中表達(dá)

3 討論

頭頸鱗癌包含種類較多，發(fā)病情況復(fù)雜，口腔鱗癌是其中的代表性鱗癌，雖然其都屬于鱗狀細(xì)胞癌，但由于發(fā)病位置不同，發(fā)病機(jī)制也各不相同。目前頭頸部的鱗狀細(xì)胞癌主要以手術(shù)治療為主，雖然隨著醫(yī)療水平的不斷發(fā)展，治療手段不斷完善，但總體預(yù)后還是不容樂觀。腫瘤的微環(huán)境與腫瘤的發(fā)展遷移密切相關(guān)，細(xì)胞外基質(zhì)中的成分與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在細(xì)胞基質(zhì)中膠原蛋白超家族是主要組成部分，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白主要包括I型、II型、III型、V型膠原蛋白。COL3A1基因編碼的III型膠原蛋白，廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)，與細(xì)胞的增殖、分化與遷移/侵襲有密切關(guān)系，但在腫瘤的的發(fā)展遷移中的作用尚未有定論。有文獻(xiàn)報(bào)道，COL3A1的高表達(dá)形成的膠原蛋白具有一定屏障作用，可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，也有文獻(xiàn)報(bào)道，COL3A1的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的侵襲與遷移[5,6]。本文通過GEPIA在線分析發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中COL3A1呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，并且在細(xì)胞水平驗(yàn)證，在惡性程度較高的腫瘤細(xì)胞株中COL3A1表達(dá)明顯增加，與數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果一致。本文同時(shí)也檢測(cè)了腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)家族中TGF-β3的表達(dá)水平。TGF-β3參與器官纖維化、創(chuàng)面愈合以及瘢痕形成等生理病理活動(dòng)并發(fā)揮促細(xì)胞增殖，遷移及促進(jìn)膠原蛋白合成及調(diào)控纖維化等作用。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β通過Smad2/3信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)膠原合成調(diào)控，可以上調(diào)COL3A1基因的表達(dá)，促進(jìn)III型膠原蛋白產(chǎn)生，在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)TGF-β3的表達(dá)與COL3A1表達(dá)趨勢(shì)相近，說明可能參與共同信號(hào)通路調(diào)控的生物反應(yīng)。

綜上所述，COL3A1的高表達(dá)在腫瘤細(xì)胞株中具有潛在的診斷意義，但由于頭頸鱗癌的種類復(fù)雜，發(fā)病位置不同，涉及的組織則不同，轉(zhuǎn)移機(jī)制也有差異，本實(shí)驗(yàn)沒有經(jīng)過大量臨床樣本驗(yàn)證，其作為生物標(biāo)志物的臨床實(shí)用性有待進(jìn)一步研究。