寧旭蘭, 喬凱凱,2, 肖 順, 石朝慧, 梁彩霞, 薛 清, 劉國坤

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，福建 福州 350002;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南 安陽 455000;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，江蘇 南京 210095)

墊刃科(Tylenchidae ?rley, 1880)線蟲是土壤線蟲中一類種類多、數(shù)量大的復(fù)雜群體，土壤樣本中該科線蟲數(shù)量可超過線蟲總數(shù)的30%，其在土壤生態(tài)系統(tǒng)或根系系統(tǒng)中均有重要的地位[1-2].目前,墊刃科有45個屬，已描述種超過412個[3]，估計仍有75%～95%的墊刃科線蟲種未被描述[4].巴茲爾屬(BasiriaSiddiqi, 1959)是土壤中常見的墊刃科線蟲屬之一，目前已鑒定44個有效種[5].我國大陸地區(qū)共發(fā)現(xiàn)該屬線蟲7種：殷友琴[6]在廣東省芒果樹根系采集到喜草本巴茲爾線蟲(B.graminophilaSiddiqi, 1959)；劉維志[7]在遼寧省馬鈴薯根系采集到尾粗巴茲爾線蟲[B.tumida(Colbran, 1960) Geraert, 1968]；廣東省苦瓜根系曾發(fā)生廣東巴茲爾線蟲新種[B.guangdongensisSyn. (RhabdotylenchusguangdongensisXie et al, 1994)][8-9]；滕文鳳等[10]在江蘇省衛(wèi)矛、秤錘樹、厚皮香苗圃地發(fā)現(xiàn)冬天巴茲爾線蟲(B.hibernaBernard, 1980)；吳慧平等[11]在安徽省桔梗根系發(fā)現(xiàn)克什米爾巴茲爾線蟲(B.kashmirensisJairajpuri, 1965)和B.pravamphidiaAndrassy, 1963；楊意伯[12]在福建省番石榴根系采集到里特巴茲爾線蟲[B.ritteri(Baqri and Jairaipuri, 1969) Bernard, 1980].作者在福建省福州市蘆葦根系和芒果樹根系土壤中各采集到1種巴茲爾墊刃線蟲，經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法鑒定，分別為畸形巴茲爾線蟲[B.aberrans(Thorne, 1949) Siddiqi, 1963]和纖細巴茲爾線蟲[B.gracilis(Thorne, 1949) Siddiqi, 1963]，均為我國新記錄種，現(xiàn)記述如下.

1 材料與方法

1.1 線蟲的采集與分離

采集時間為2018年10月，采集地為福建省福州市連江縣(26°12′13.02″N、119°33′07.28″E，海拔35 m)蘆葦叢根系和福建農(nóng)林大學(xué)(26°05′09.12″N、119°14′05.21″E，海拔14 m)芒果樹根系.采集土層8～20 cm，采用淺盤法[13]分離線蟲，用500目(孔徑25 μm)網(wǎng)篩收集分離液.

1.2 形態(tài)鑒定

挑取線蟲，用4%甲醛溶液固定，制成臨時玻片標(biāo)本，指甲油封邊，在Nikon顯微鏡(Eclipse Ni-U 931609)下觀察、拍照，并利用測量軟件和De Man公式[14]測量和計算各形態(tài)指標(biāo).經(jīng)4%甲醛溶液固定的線蟲，經(jīng)過甘油-乙醇脫水法[15]制成永久玻片標(biāo)本保存.

1.3 分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 DNA提取與PCR擴增及測序 采用蛋白酶K法提取線蟲DNA.離心管中加入10 μL線蟲裂解液WLB(50 mmol·L-1KCl、10 mmol·L-1Tris、2.5 mmol·L-1MgCl2、0.45% NP 40、4.5% Tween 20，pH=8.3)，將單條線蟲挑入離心管中，用液氮冷凍1 min后取出，加入1 μL蛋白酶K(1.0 mg·mL-1)，再放入PCR儀中溫育(65 ℃ 1 h，95 ℃ 10 min)[16].

PCR擴增：擴增核糖體RNA(rRNA)靶標(biāo)基因18S區(qū)和28S D2-D3區(qū).18S區(qū)全長用2對引物擴增[17]，分別為988F(CTCAAAGATTAAGCCATGC)/1912R(TTTACGGTCAGAACTAGGG)和1813F(CTGCGTGAGAGGTGAAAT)/2646R(GCTACCTTGTTACGACTTTT).28S D2-D3區(qū)用引物對D2A(ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT)/D3B(TCGGAAGGAACCAGCTACTA)擴增[18].通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.采用25 μL擴增體系：7.5 μL ddH2O，12.5 μL Premix TaqTM(TAKARA，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，上、下游引物各1 μL，DNA模板3 μL.18S區(qū)擴增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，重復(fù)40次；72 ℃延伸10 min.28S D2-D3區(qū)擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，重復(fù)35次；72 ℃延伸10 min.

擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序.用軟件Geneious檢驗測序質(zhì)量并進行序列的比對、拼接、頭尾修飾，將目標(biāo)序列提交至GenBank獲取序列號.

1.3.2 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 運用CIPRES在線平臺采用貝葉斯法(Bayesian inference, BI)和極大似然法(maximum likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[19].用MAFFT比對方法中的Q-INS-I算法進行序列的多重比對[20]；選擇MrBayes轉(zhuǎn)換Nexus格式，選擇RAxML轉(zhuǎn)換Phylip格式；BI選擇程序MrBayes on XSEDE(3.2.6)，采用GTR+I+G模型，運算5 000 000代，每運算100代對樹形進行Markov chains采樣，并剔除初始25%采樣[21]；ML則選擇RAxML-HPC2 on XSEDE程序[22]，采用GTRCAT模型，完成1 000次自展重復(fù)；最后采用軟件Figtree v1.4.3[23]和Adobe Illustrator CC在貝葉斯50%多數(shù)原則一致樹上標(biāo)注自展值(BS)和后驗概率(PP).

2 結(jié)果與分析

蘆葦根系每百克土壤中的巴茲爾線蟲數(shù)平均為13.2條；芒果樹根系每百克土壤中的巴茲爾線蟲數(shù)平均為16.8條.

2.1 形態(tài)特征

分離到的2個種群均符合墊刃科叉針亞科(Boleodorinae)巴茲爾屬的識別特征：蟲體線狀，細??；頭部高，側(cè)器孔斜裂或V形，位于頭部的側(cè)面，明顯；口針細小，基部球小，長度為7～14 μm，骨質(zhì)化弱，針錐占口針長約1/3；食道前體部較細，中食道球弱至中等發(fā)達，具瓣，體前端至中食道球中間的長度占食道總長的34%～60%，后食道球短，梨形，與腸平接；側(cè)區(qū)側(cè)線有2、4或6條；雌蟲單生殖管；尾細長，末端絲狀、圓錐或鈍圓狀.

2.1.1 蘆葦線蟲種群的形態(tài)描述 雌蟲:蟲體細小，經(jīng)熱處理固定后，蟲體略向腹部彎曲，長636～746 μm；角質(zhì)膜有明顯環(huán)紋；口針弱，微彎曲，基部球小(圖1A)；側(cè)區(qū)有4條側(cè)線(圖1B)；中食道球橢圓形，瓣門骨質(zhì)化弱，處于食道中靠后的位置；后食道球短，梨形，與腸平接(圖1C)；單生殖管，儲精囊內(nèi)大多空，少數(shù)可見精子；尾部伸直，末端鈍圓，部分呈棍棒狀或圓形(圖1D).具體形態(tài)測計值見表1.

雄蟲:未發(fā)現(xiàn).

A-D:畸形巴茲爾線蟲的口針、側(cè)線、體前部、尾部;E-H:纖細巴茲爾線蟲的口針、側(cè)線、體前部、尾部.標(biāo)尺=10 μm.圖1 2種巴茲爾線蟲雌蟲的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of female Basiria spp.

表1 蘆葦線蟲種群形態(tài)測計值1)Table 1 Morphometrics of female nematode population from reed rhizosphere

蘆葦線蟲種群的形態(tài)測計值均在畸形巴茲爾線蟲原始描述種形態(tài)測計值[24]范圍內(nèi).蘆葦線蟲種群與畸形巴茲爾線蟲近似種B.graminophila[9]相比，前者口針略彎曲，口針基部球末端至背食道腺開口的距離(DGO)為7.89 μm，而后者口針直,DGO緊鄰口針球基部；與B.khouzestanensis[5]相比，蘆葦線蟲種群體型大(636～746 μm vs 430～635 μm)，最大體寬數(shù)值大(16.0～20.9 μm vs 12.8～15.6 μm).因此將蘆葦線蟲種群初步鑒定為畸形巴茲爾線蟲.

2.1.2 芒果樹線蟲種群的形態(tài)描述 雌蟲:細小，經(jīng)熱處理固定后，蟲體伸直或略微彎曲，體長564～675 μm；環(huán)紋明顯；頭部橢圓，略微縊縮；口針骨質(zhì)化弱，針錐部為口針長的1/3左右(圖1E)；側(cè)區(qū)有2條明顯側(cè)線(圖1F)；中食道球位于食道中后部，卵圓形，瓣門弱；后食道球梨形，與腸平接(圖1G)；儲精囊卵圓形，未見精子；尾部長，逐漸變細，尾端圓(圖1H).具體形態(tài)測計值見表2.

表2 芒果樹線蟲種群形態(tài)測計值1)Table 2 Morphometrics of female nematode population from mango tree rhizosphere

雄蟲:未發(fā)現(xiàn).

芒果樹線蟲種群與纖細巴茲爾線蟲原始描述種[24]比較，除了口針長度略微偏小(7.7～9.5 μm vs 9.0～12.5 μm)外，其他形態(tài)特征基本符合，而口針長度的差異可能是由生長環(huán)境不同導(dǎo)致的.芒果樹線蟲種群與纖細巴茲爾線蟲近似種B.paragracilics[9]相比，前者口針基部球明顯，而后者無基部球；芒果樹線蟲種群與B.pravamphidia和B.tritici[9]相比，前者尾部逐漸變細，尾端圓，而后兩種線蟲尾部細尖，且B.tritici陰門至肛門距離更短.因此將芒果樹線蟲種群初步鑒定為纖細巴茲爾線蟲.

2.2 系統(tǒng)進化樹分析

兩個線蟲種群的18S區(qū)經(jīng)測序共獲得5條序列，上傳GenBank獲得序列號：蘆葦線蟲種群序列號為MK639389、MK639390和MK639391，序列長度分別為1 726、1 735和1 729 bp；芒果樹線蟲種群序列號為MK639394和MK639395，序列長度分別為1 733和1 730 bp.下載GenBank中墊刃科線蟲的29條18S序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2).經(jīng)BLAST比對，蘆葦線蟲種群3條序列與伊朗發(fā)現(xiàn)的畸形巴茲爾線蟲序列 (KJ869415)相似性均在99.77%以上；在系統(tǒng)進化樹(圖2)上，蘆葦線蟲種群與畸形巴茲爾線蟲 (KJ869415)聚在一起，并且與喜草本巴茲爾線蟲(KJ869317)處于同一分支(PP=0.99，BS=100).芒果樹線蟲種群的2條序列與美國發(fā)現(xiàn)的纖細巴茲爾線蟲序列(EU130839)一致性為98.73%，與伊朗發(fā)現(xiàn)的纖細巴茲爾線蟲序列(KJ869351)一致性為98.84%；系統(tǒng)進化樹(圖2)顯示，芒果樹線蟲種群與纖細巴茲爾線蟲聚在同一分支，且支持度較高(PP=0.99，BS=98).

兩個種群的28S D2-D3區(qū)經(jīng)測序共獲得4條序列，上傳GenBank得到序列號.蘆葦線蟲種群序列MK639371、MK639372的長度分別為648、645 bp，與伊朗發(fā)現(xiàn)的未定種Basiriasp.(JQ004998、JQ005000)的一致性最高，達99%，與Basiriasp.(MK644825)的一致性為98%；系統(tǒng)進化樹(圖3)表明，這5個序列形成一個完全支持的支系(PP=1,BS=100)，且與湖澤斯坦巴茲爾線蟲(B.khouzestanensis)互為姊妹群.芒果樹線蟲種群序列MK639375、MK639376的長度分別為763、774 bp，與纖細巴茲爾線蟲(DQ328717)、巴茲爾線蟲未知種Basiriasp.(DQ077803)一致性最高，為93%；在系統(tǒng)進化樹(圖3)上，這4個序列共同處于支持度較高的一個分支中(PP=0.99，BS=98),且與喜草本巴茲爾線蟲互為姊妹群.

粗體表示本研究獲得的5個序列. 分支數(shù)值為貝葉斯法所得概率(PP)/極大似然法所得自展值(BS).圖2 基于18S rRNA基因序列建立的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogeny tree based on the 18S rRNA sequences

綜合形態(tài)特征和分子系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果，分別將蘆葦線蟲種群和芒果樹線蟲種群確定為畸形巴茲爾線蟲和纖細巴茲爾線蟲.

3 討論

本研究利用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法，分別從福建省蘆葦和芒果樹土壤中鑒定出畸形巴茲爾線蟲和纖細巴茲爾線蟲2個中國新記錄種.兩種線蟲的形態(tài)特征與喜草本巴茲爾線蟲差異小，在系統(tǒng)進化樹上的親緣關(guān)系也接近.Eisvand et al[5]認為,喜草本巴茲爾線蟲與13個巴茲爾線蟲種的形態(tài)特征很接近(B.babhi、B.binaria、B.brevia、B.haki、B.imphalensis、B.kashmirensis、B.lathyrae、B.lauta、B.macrostriata、B.raskiensis、B.shahidi、B.simhai、B.tenuis)，這些種都可歸為喜草本巴茲爾線蟲組群(group).

粗體表示本研究獲得的4個序列. 分支數(shù)值為貝葉斯法所得后驗概率(PP)/極大似然法所得自展值(BS).圖3 基于28S D2-D3區(qū)基因序列建立的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogeny tree based on the D2-D3 domain of 28S rRNA sequences

墊刃科線蟲種類多，進化復(fù)雜，基于已知的墊刃科線蟲的18S、28S D2-D3、線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ基因(COⅠ)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中，有的屬、種存在解析度與支持率低的狀況，因此尚未建立系統(tǒng)的墊刃科線蟲進化構(gòu)架[25].在現(xiàn)有的墊刃科線蟲分類體系中，大多數(shù)屬為并系(paraphyly)或多系(polyphyly)，僅有少數(shù)屬為單系(monophyly)，如頭墊刃線蟲屬(Cephalenchus)、野外墊刃線蟲屬(Aglenchus)和具脊墊刃線蟲屬(Coslenchus)等.前人基于已有的少量樣本研究顯示，巴茲爾屬為單系[26].本研究通過18S和28S D2-D3序列分析表明巴茲爾屬為多系，屬內(nèi)不同種分別分布于兩個支持度較高的分支上，且其中混雜著新平滑墊刃屬(Neopsilenchus)和圓盤波斯屬(Discopersicus).劍尾墊刃屬(Malenchus)和雙刃斧線蟲屬(Labrys)均存在類似現(xiàn)象[16,27].目前，GenBank上巴茲爾屬線蟲的序列數(shù)量較少，且該屬線蟲的形態(tài)學(xué)信息也較為匱乏.因此，今后需要更多的研究充實其分子與形態(tài)信息，以進一步完善其分類系統(tǒng).