黃遠(yuǎn)東，何 郎，趙曉平，楊大興，徐 毅，曾祥華，劉 芳（.成都市第五人民醫(yī)院，四川 成都 630；.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000）

肺癌是我國常見的一種惡性腫瘤，具有發(fā)病率與死亡率高等特點(diǎn)，已嚴(yán)重威脅人類身體健康，中藥提取物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，并可抑制肺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[1-4]。延齡草總皂苷是延齡草中的主要活性成分，具有抗高血壓等作用，研究[5]顯示延齡草總皂苷可抑制宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲。但延齡草總皂苷對肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未知。微小RNA（microRNA，miR）在腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，miR-1470在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，抑制miR-1470可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和遷移[6]。因此，本研究主要探討延齡草總皂苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其對miR-1470的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

延齡草（亳州市億弘堂藥業(yè)有限公司）；人肺癌A549細(xì)胞（美國ATCC細(xì)胞庫）；Lipofectamine2000、凋亡試劑盒、MTT、Matrigel基質(zhì)膠（北京索萊寶科技有限公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；antimiR-NC、anti-miR-1470、miR-NC、miR-1470 mimics（廣州銳博生物技術(shù)有限公司）；Trizol試劑（美國Thermo Fisher公司）；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；兔抗人Ki-67、MMP-2、MMP-9抗體（美國Santa Cruz公司）；二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 延齡草總皂苷：取延齡草粉碎，使用60目篩篩選，加入70%乙醇浸泡3 h，回流提取3次（1.5 h·次-1），收集提取液后減壓濃縮，冷凍干燥后得到延齡草總皂苷（純度> 95%），根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求稀釋至0.5、1、2 mg·L-1。A549細(xì)胞分別加入含有上述不同濃度延齡草總皂苷的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別記為延齡草總皂苷低劑量組、延齡草總皂苷中劑量組、延齡草總皂苷高劑量組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞記為對照組。anti-miR-NC、anti-miR-1470分別轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞培養(yǎng)24 h，分別記為anti-miR-NC組、antimiR-1470組。miR-NC、miR-1470 mimics分別轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞后加入含有濃度為2 mg·L-1延齡草總皂苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為延齡草總皂苷+ miR-NC組、延齡草總皂苷+ miR-1470組[7]。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖 各組A549細(xì)胞接種于96孔板（150 μL·孔-1）后加入MTT溶液（20 μL·孔-1），4 h后棄上清，加入DMSO（150 μL·孔-1）后繼續(xù)培養(yǎng)5 min，檢測各孔吸光度值（OD 490 nm）并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移與侵襲 遷移：A549細(xì)胞加入小室的上室（200 μL·孔-1），下室加入600 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，24 h后分別加入多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，觀察遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲：Matrigel基質(zhì)膠后加入小室的上室（40 μL·孔-1），后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-1470的表達(dá)水平 提取各組A549細(xì)胞RNA，嚴(yán)格按照Trizol試劑盒說明書操作，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系與設(shè)置反應(yīng)條件，應(yīng)用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測miR-1470相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blot檢測Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 提取各組A549細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋比為1∶1000的一抗后置于4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗滌后加入稀釋比為1∶2000的二抗，將其置于室溫條件下孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 延齡草總皂苷對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較，延齡草總皂苷低劑量組、延齡草總皂苷中劑量組、延齡草總皂苷高劑量組細(xì)胞增殖抑制率升高（P< 0.05），Ki-67蛋白水平降低（P< 0.05），且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見表1。

表1 延齡草總皂苷對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響. n = 9Tab 1 Effect of trillium saponins on the proliferation of lung cancer A549 cells. n = 9

2.2 延齡草總皂苷對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響

與對照組比較，延齡草總皂苷低劑量組、延齡草總皂苷中劑量組、延齡草總皂苷高劑量組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P< 0.05），MMP-2、MMP-9蛋白水平降低（P< 0.05），且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見表2。

表2 延齡草總皂苷對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響. n = 9Tab 2 Effect of trillium saponins on the migration and invasion of lung cancer A549 cells. n = 9

2.3 延齡草總皂苷對肺癌A549細(xì)胞miR-1470表達(dá)的影響

與對照組比較，延齡草總皂苷低劑量組、延齡草總皂苷中劑量組、延齡草總皂苷高劑量組miR-1470的表達(dá)水平降低（P< 0.05），且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見表3。

表3 延齡草總皂苷對肺癌A549細(xì)胞miR-1470表達(dá)的影響. n = 9Tab 3 Effect of trillium saponins on the expression of miR-1470 in lung cancer A549 cells. n = 9

2.4 抑制miR-1470表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與anti-miR-NC組比較，anti-miR-1470組細(xì)胞增殖抑制率升高（P< 0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P< 0.05），Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低（P< 0.05），見表4。

表4 抑制miR-1470表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響. n = 9Tab 4 Effect of inhibiting the expression of miR-1470 on the proliferation, migration and invasion of lung cancer A549 cells. n = 9

2.5 miR-1470過表達(dá)逆轉(zhuǎn)延齡草總皂苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

與延齡草總皂苷+miR-NC組比較，延齡草總皂苷+miR-1470組細(xì)胞增殖抑制率降低（P< 0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯增多（P< 0.05），Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高（P< 0.05），見表5。

表5 miR-1470過表達(dá)逆轉(zhuǎn)延齡草總皂苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用. n = 9Tab 5 Overexpression of miR-1470 reversed the effects of trillium saponins on the proliferation, migration and invasion of lung cancer A549 cells. n = 9

3 討論

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)中藥提取物具有抗肺癌的作用，并可通過調(diào)控多種途徑或多個(gè)靶點(diǎn)基因而發(fā)揮作用[8-10]，以往研究證實(shí)延齡草總皂苷可能通過抑制IL-6/STAT3信號通路而抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲[11]，可抑制乳腺癌、宮頸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-13]。有研究表明Ki-67表達(dá)水平升高預(yù)示細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)[14]，本研究結(jié)果顯示，延齡草總皂苷處理后的肺癌細(xì)胞增殖抑制率升高，而Ki-67蛋白水平降低，且隨著藥物劑量的增加而明顯變化。本研究結(jié)果證實(shí)延齡草總皂苷可抑制肺癌細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性。MMP-2、MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶，其在肺癌中表達(dá)水平升高可降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果顯示，延齡草總皂苷處理后的肺癌細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)均明顯減少，MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，且呈劑量依賴性，提示延齡草總皂苷可抑制肺癌細(xì)胞遷移及侵襲。延齡草總皂苷能夠降低肺癌細(xì)胞中miR-1470的表達(dá)水平，且隨著藥物劑量的增加而明顯降低。研究表明miR-1470在肝癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，并可通過靶向ALX4而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及抑制細(xì)胞凋亡[16-17]。本研究結(jié)果證實(shí)miR-1470過表達(dá)可明顯拮抗延齡草總皂苷對肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示延齡草總皂苷能夠降低肺癌細(xì)胞中miR-1470的表達(dá)水平，抑制miR-1470表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，miR-1470可能作為延齡草總皂苷治療肺癌的潛在靶點(diǎn)，為進(jìn)一步揭示延齡草總皂苷治療肺癌的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。