佟 玲，李義慧，李 佳，王建功（.唐山市人民醫(yī)院藥劑科，河北 唐山 06000；.唐山市人民醫(yī)院腫瘤綜合治療科，河北 唐山06000；.唐山市人民醫(yī)院放化一科，河北 唐山 06000）

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌的一種類型，具有較高的復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性[1]，而血管生成對(duì)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，血管生成主要由通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）誘導(dǎo)[2]。阿帕替尼（apatinib，APA）是一種口服的小分子抗血管生成靶向藥物，其可以通過(guò)與VEGFR-2結(jié)合并抑制其功能，在我國(guó)阿帕替尼已經(jīng)被批準(zhǔn)用于晚期胃癌的治療[3]，其在乳腺癌中的應(yīng)用正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，一項(xiàng)Ⅱ期臨床研究結(jié)果顯示大劑量阿帕替尼對(duì)于TNBC具有一定的治療效果[4]。一項(xiàng)體外研究顯示阿帕替尼可以抑制TNBC細(xì)胞的增殖和遷移[5]，但是關(guān)于阿帕替尼在TNBC中的作用和機(jī)制尚不明確。有體內(nèi)研究顯示阿帕替尼可通過(guò)抑制ERK/JAK2-STAT3抑制食管癌的進(jìn)展[6]。本文旨在探討阿帕替尼通過(guò)ERK/JAK2-STAT3途徑對(duì)TNBC的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人TNBC細(xì)胞系MDA-MB-468細(xì)胞株（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）。BALB/c裸鼠（雌性，4 ～ 5周齡，SPF級(jí)，南京金陵醫(yī)院）。DMEM培養(yǎng)基血清和抗體（美國(guó)Invitrogen公司）。阿帕替尼（美國(guó)MCE公司）。逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒（瑞士Roche公司）。anti-VEGFR-2、anti-ERK、anti-p-ERK、anti-JAK2、anti-STAT3、anti-p-STAT3（美國(guó)Abcam公司）。PVDF膜（美國(guó)Bio-Rad公司）。TUNEL凋亡染色試劑盒。倒置顯微鏡（日本Olympus IX71）。

1.2 荷瘤裸鼠模型建立、分組及干預(yù)方法

將MDA-MB-468細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-468細(xì)胞消化、洗滌、重懸細(xì)胞（密度為1×107個(gè)·mL-1）。將0.2 mL的細(xì)胞懸液注射在腋下。每日觀察腫瘤生成情況，在建模14 d時(shí)經(jīng)過(guò)測(cè)量和計(jì)算腫瘤體積大于60 mm3提示建模成功。

選擇18只建模成功的小鼠分為3組（n= 6）：對(duì)照組、低劑量APA組（4.15 mg·kg-1，qd，灌胃）和高劑量APA組（8.30 mg·kg-1，qd，灌胃）[7]。對(duì)照組小鼠使用等量的生理鹽水灌胃，qd，連續(xù)14 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 腫瘤體積和質(zhì)量 在干預(yù)后第14 d通過(guò)頸脫臼處死小鼠，取出腫瘤組織，擦干體液后測(cè)量腫瘤體積和質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。

1.3.2 TUNEL染色檢測(cè)凋亡 將腫瘤組織固定后透化，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分別進(jìn)行TUNEL染色和細(xì)胞核染色，然后進(jìn)行封片。其中細(xì)胞核被染為藍(lán)色，棕色為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，提示凋亡，并計(jì)算凋亡率。

1.3.3 免疫組化染色檢測(cè)Ki-67 將腫瘤組織用甲醛固定、石蠟包埋，切片后進(jìn)行脫石蠟、水合以及抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性處理。封閉切片并在4 ℃下加入Bcl-2抗體孵育過(guò)夜，然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)加入二抗進(jìn)行顯色。通過(guò)觀察Ki-67的染色情況分析增殖情況。通過(guò)半定量法分析Ki-67的染色強(qiáng)度。

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白 將腫瘤組織裂解后收集總蛋白，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白量。每組樣品取30 μg蛋白在120 V/90 min條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并加入5%脫脂牛奶作為封閉溶液。分別將anti-VEGFR-2、anti-ERK、anti-p-ERK、anti-JAK2、anti-STAT3、anti-p-STAT3稀釋500倍，然后分別加入PVDF膜孵育過(guò)夜（< 4 ℃），加入HRP偶聯(lián)二抗（1∶5000稀釋）在室溫下孵育1 h。ECL對(duì)蛋白進(jìn)行可視化處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料使用“%”表示，進(jìn)行單因素方差分析，P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建模情況概述

本次研究中共使用20只小鼠建立荷瘤模型，其中18只小鼠腫瘤體積大于60 mm3，建模成功率為90.00%。

2.2 阿帕替尼對(duì)TNBC荷瘤裸鼠模型的腫瘤抑制作用

通過(guò)對(duì)各組腫瘤體積、質(zhì)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)低劑量APA組、高劑量APA組的腫瘤體積和質(zhì)量均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；且高劑量APA組的腫瘤體積和質(zhì)量顯著低于低劑量APA組（P< 0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組腫瘤體積、質(zhì)量和抑瘤率比較. n = 6Tab 1 Comparison of tumor volume, quality and tumor inhibition rate in each group. n = 6

2.3 阿帕替尼對(duì)TNBC荷瘤裸鼠模型中腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

干預(yù)后低劑量A PA組腫瘤細(xì)胞凋亡率為（17.34±2.68）%，高劑量APA組為（24.52±3.27）%，均高于對(duì)照組的（3.16±0.58）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；且高劑量APA組的凋亡率顯著高于低劑量APA組（P< 0.05）。

2.4 各組增殖情況比較

干預(yù)后低劑量APA組的Ki-67染色評(píng)分為（6.34±1.58）分、高劑量APA組為（4.63±1.26）分，低于對(duì)照組的（8.82±1.85）分，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；且高劑量APA組的Ki-67染色評(píng)分顯著低于低劑量APA組（P< 0.05）。

2.5 各組VEGFR-2和ERK通路水平比較

干預(yù)后低劑量APA組與高劑量組的VEGFR-2蛋白表達(dá)水平和ERK蛋白磷酸化水平均低于對(duì)照組（P< 0.05）；且高劑量APA組的VEGFR-2蛋白表達(dá)水平顯著低于低劑量APA組（P< 0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 各組VEGFR-2蛋白表達(dá)水平和ERK蛋白磷酸化水平比較. n = 6Tab 2 Comparison of VEGFR-2 protein expression level and ERK protein phosphorylation level in each group. n = 6

2.6 各組JAK2-STAT3通路水平比較

干預(yù)后低劑量APA組與高劑量APA組的JAK2-STAT3蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P< 0.05）；且高劑量APA組的JAK2-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著低于低劑量APA組（P< 0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 各組JAK2-STAT3通路水平比較Tab 3 Comparison of JAK2-STAT3 pathway level in each group

3 討論

TNBC的發(fā)病率占乳腺癌總數(shù)的17% ～ 20%[7]?，F(xiàn)階段治療TNBC的主要方法包括手術(shù)治療、化學(xué)療法和放射療法，其中化學(xué)療法是最常用的治療方法之一，但仍有部分患者預(yù)后不佳。近年來(lái)，抗血管生成藥物在乳腺癌的治療中取得了一定進(jìn)展，臨床研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼對(duì)晚期乳腺癌具有一定的療效，且不良反應(yīng)可控，但其在TNBC中的作用仍需要進(jìn)一步研究[8]。小分子激酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提高了對(duì)腫瘤的治療效果，阿帕替尼是我國(guó)首個(gè)自主研發(fā)的口服藥物，其在晚期胃癌中具有顯著療效[9]，與抗血管生成藥物貝伐珠單抗比較，阿帕替尼具有經(jīng)濟(jì)、安全性高的特點(diǎn)[10]，最新的研究也顯示其在乳腺癌中也有較好的作用[11-13]。本文通過(guò)皮下注射TNBC細(xì)胞系MDA-MB-468構(gòu)建荷瘤裸鼠模型，分別使用不同劑量的阿帕替尼灌胃，發(fā)現(xiàn)高劑量APA組抑瘤率為（31.37±1.95）%，顯著高于低劑量APA組，阿帕替尼促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制增殖的能力具有劑量依賴性。有研究[14]顯示阿帕替尼聯(lián)合常規(guī)化療可有效治療TNBC，其效果和安全性良好。Li等[15]研究結(jié)果顯示阿帕替尼聯(lián)合卡培他濱對(duì)于晚期TNBC具有較好的治療效果，提示阿帕替尼對(duì)于TNBC具有較好的控制作用。

VEGFR-2是促進(jìn)血管和淋巴管生成的重要細(xì)胞因子，阿帕替尼的抗腫瘤活性通過(guò)抑制VEGFR-2從而抑制TNBC進(jìn)展[16]。研究[17]顯示VEGFR-2可以通過(guò)促進(jìn)ERK通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。本次研究結(jié)果顯示阿帕替尼可劑量依賴性的抑制TNBC荷瘤裸鼠模型腫瘤組織中的VEGFR-2、ERK通路和JAK-STAT通路。有研究顯示阿帕替尼可以通過(guò)抑制ERK通路抑制膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[18]。Liu等[19]研究結(jié)果也顯示阿帕替尼可通過(guò)抑制ERK通路提高肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Guo等[20]發(fā)現(xiàn)在胃癌中，阿帕替尼耐藥性的出現(xiàn)與JAK-STAT通路的激活有關(guān)。Ding等[21]研究結(jié)果顯示阿帕替尼可通過(guò)抑制JAKSTAT通路抑制卵巢癌上皮細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。以上研究提示阿帕替尼可抑制TNBC中的ERK和JAK-STAT通路。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示阿帕替尼可通過(guò)抑制ERK和JAK-STAT通路抑制TNBC荷瘤裸鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，但關(guān)于阿帕替尼治療TNBC的療效、安全性和機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。