敖道夫，榮 君，小 花，巴乙拉嘎，陳紅梅

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

心肌缺血（myocardial ischemia）是指心臟的血液灌注減少，導(dǎo)致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。目前心肌缺血在我國(guó)的患病率呈逐年上升的趨勢(shì)，已成為中老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)病，甚至20～30歲的年輕人也出現(xiàn)心肌缺血的表現(xiàn)。臨床上對(duì)嚴(yán)重的心肌缺血可實(shí)行冠脈搭橋術(shù)、冠狀動(dòng)脈介入治療，但治療費(fèi)用昂貴，不易被廣大患者所接受，藥物治療仍然是這類疾病的主要防治方式。

蒙藥紹沙七味丸出自《驗(yàn)方》，是治療心臟病的常用蒙藥，由廣棗、丁香、肉豆蔻、沉香、木香、阿魏、野牦牛心組成，具有抑心赫依、安神定志、增強(qiáng)心功能效果，用于治療心赫依、心悸、心衰、氣喘、失眠、胸痛、癲狂等癥[1]，故沿用至今。該藥物治療心臟疾病療效確切，對(duì)冠心病、心肌缺血、心絞痛、心悸、慢性心力衰竭等疾病臨床療效顯著，無(wú)不良反應(yīng)[2-4]，可達(dá)到標(biāo)本兼顧的功效。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)蒙藥紹沙七味丸的臨床應(yīng)用情況及療效，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈建立心肌缺血大鼠模型，探討該藥物對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用及其炎癥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物11周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠70只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自長(zhǎng)春市伊斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，飼養(yǎng)溫度22～25℃，濕度45%～65%，光照12 h明暗交替，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：NM-LL-2017-03-09-01。

1.2 藥物與試劑 蒙藥紹沙七味丸（內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥房，批號(hào)：20180225，規(guī)格：15 g/瓶），粉碎成細(xì)粉，用0.5%CMC-Na緩沖溶液配制成所需質(zhì)量濃度使用；復(fù)方丹參片（鄭州瑞龍制藥股份有限公司，批號(hào)：180314）；CK-MB（批號(hào)：34413701）、LDH（批號(hào)：35625301）[羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司]；IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)：20160507A）、TNF-α ELISA試劑盒（批號(hào)：20160428A）（上海源葉生物科技有限公司）；NF-kB抗體（北京博奧森生物有限公司，貨號(hào)：bs-1704R）。

1.3 主要儀器Animal Bio Amp心電圖儀[艾德儀器國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]；HX-300S動(dòng)物人工呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；SC-05低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Cobas C311羅氏生化分析儀（日本hitachi high technologies公司）；SUNRISE酶標(biāo)儀（奧地利亞Tecan）；RM2245石蠟切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；HI1210組織烘片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；HI1220組織攤片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；EG1150H組織包埋機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；101A-2E電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；U410-86超冷凍冰箱（英國(guó)Eppendorf公司）。

1.4 分組與給藥 從70只大鼠中隨機(jī)取10只作為正常組，其余60只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、蒙藥紹沙七味丸低劑量組、蒙藥紹沙七味丸中劑量組、蒙藥紹沙七味丸高劑量組和復(fù)方丹參片組，每組12只。根據(jù)等效劑量計(jì)算，蒙藥紹沙七味丸低、中、高劑量組大鼠分別以0.80、1.60、3.20 g/kg劑量灌胃蒙藥紹沙七味丸溶液；復(fù)方丹參片組大鼠按0.25 g/kg劑量灌胃給予復(fù)方丹參片溶液，正常組、模型組大鼠給予等體積的蒸餾水。給藥體積為2 mL/100 g，1次/d，連續(xù)給藥14 d。

1.5 造模方法 大鼠手術(shù)前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛麻醉，固定在專用固定板上，連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，檢測(cè)大鼠心電圖，將大鼠氣管切開(kāi)，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。方法如下：胸部備皮，沿左胸骨中線切開(kāi)線形皮膚約2～3 cm缺口，在第4肋間開(kāi)胸，擴(kuò)胸，除去心包膜，擠出心臟，在左心耳根部和肺動(dòng)脈圓錐交界處，穿細(xì)線結(jié)扎[5]。觀察結(jié)扎線以下心肌顏色發(fā)生變化（左心室心肌呈充血暗紅色，且前壁運(yùn)動(dòng)減弱），并且心電圖S-T段顯著抬高，說(shuō)明成功復(fù)制急性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ蚚6]。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 血清指標(biāo)的測(cè)定 造模成功后3 h從腹主動(dòng)脈采血，置于室溫10 min，低溫高速離心機(jī)以3 500 r/min離心10 min，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）水平；ELISA法檢測(cè)血清IL-6、TNF-α的含量。

1.6.2 心臟組織病理學(xué)觀察 處死動(dòng)物后取心臟組織固定在4%多聚甲醛中，石蠟包埋，3μm厚度切片做HE染色，光學(xué)顯微鏡400倍條件下觀察心臟組織病理變化。

1.6.3 心臟組織NF-κB蛋白表達(dá)的檢測(cè) 每組隨機(jī)取6只大鼠心臟組織，在4%多聚甲醛固定，根據(jù)試劑盒的要求免疫組化法檢測(cè)腎組織的NF-κB蛋白表達(dá)，免疫組化最后采用Motic Images Advanced3.2圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度用光密度值（OD值）表示；OD值越小陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度越弱既表達(dá)量少，OD值越大陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)既表達(dá)量多。每張切片400倍光學(xué)顯微鏡下，選取連續(xù)5個(gè)視野測(cè)定所得的平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在造模手術(shù)過(guò)程中模型組死亡1只，原因?yàn)槁孕乃ィ幻伤幗B沙七味丸低劑量組死亡2只，原因?yàn)楹粑ソ摺⑹а孕菘?；蒙藥紹沙七味丸高劑量組死亡1只，原因?yàn)槁孕乃?。因此，各組大鼠數(shù)量最終確定為10只。

2.1 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較 模型組大鼠血清CK-MB、LDH水平均明顯高于正常組（P〈0.01）；蒙藥紹沙七味丸低、中、高劑量組和復(fù)方丹參片組大鼠血清CK-MB、LDH水平均明顯低于模型組（P〈0.05或P〈0.01），蒙藥紹沙七味丸中劑量組大鼠血清CK-MB水平低于復(fù)方丹參片組（P〈0.05），LDH水平與復(fù)方丹參片組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見(jiàn)表1）

表1 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較（±s，mmol/L）

表1 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較（±s，mmol/L）

注：與正常組比較，aP〈0.01；與模型組比較，bP〈0.05，cP〈0.01；與復(fù)方丹參片組比較，dP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）CK-MB LDH正常組 10 - 55.29±2.97 232.57±14.95模型組 10 - 173.59±9.16a 558.38±15.53a蒙藥紹沙七味丸低劑量組10 0.80 165.13±6.57b 539.50±12.16b蒙藥紹沙七味丸中劑量組10 1.60 158.39±7.52cd 498.14±10.93c蒙藥紹沙七味丸高劑量組10 3.20 159.82±7.04c 508.83±13.30c復(fù)方丹參片組 10 0.25 165.04±7.13b 502.33±11.67c

2.2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較 模型組大鼠血清IL-6、TNF-α含量明顯高于正常組（P〈0.01）；蒙藥紹沙七味丸中、高劑量組和復(fù)方丹參片組大鼠血清IL-6含量均明顯低于模型組（P〈0.05或P〈0.01），蒙藥紹沙七味丸低劑量組大鼠血清IL-6含量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；蒙藥紹沙七味丸低、中、高劑量組和復(fù)方丹參片組大鼠血清TNF-α含量均明顯低于模型組（P〈0.05或P〈0.01）。（見(jiàn)表2）

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，aP〈0.01；與模型組比較，bP〈0.05，cP〈0.01

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）IL-6 TNF-α正常組 10 - 18.26±1.67 49.64±4.83模型組 10 - 29.83±2.12a 63.41±6.59a蒙藥紹沙七味丸低劑量組10 0.80 28.20±1.55 56.29±6.31b蒙藥紹沙七味丸中劑量組10 1.60 26.63±0.92c 54.34±6.99c蒙藥紹沙七味丸高劑量組10 3.20 27.27±1.50c 54.08±7.85b復(fù)方丹參片組 10 0.25 27.75±1.91b 54.31±6.39c

2.3 各組大鼠心臟組織病理學(xué)改變情況 正常組大鼠心肌纖維排列規(guī)則、緊密，心肌纖維細(xì)胞核長(zhǎng)橢圓形，心肌纖維間未見(jiàn)出血、滲出物、炎癥細(xì)胞；模型組大鼠大部分心肌纖維排列紊亂、松散、心肌纖維斷裂、細(xì)胞核固縮，心肌纖維間可見(jiàn)大量出血、滲出物，少量炎癥細(xì)胞；蒙藥紹沙七味丸低劑量組大鼠心肌纖維間可見(jiàn)較多出血滲出物，但較模型組病變程度輕；蒙藥紹沙七味丸中劑量組大鼠病變程度輕于蒙藥紹沙七味丸低劑量組，部分心肌纖維排列紊亂、松散、心肌纖維斷裂、細(xì)胞核固縮，心肌纖維間可見(jiàn)出血、滲出物；蒙藥紹沙七味高劑量組大鼠病變程度輕于蒙藥紹沙七味丸中劑量組，心肌纖維間可見(jiàn)少量出血、滲出物，極少量炎癥細(xì)胞；復(fù)方丹參片組大鼠病變較為嚴(yán)重，心肌纖維排列紊亂、松散、纖細(xì)、心肌纖維斷裂、細(xì)胞核固縮，心肌纖維間可見(jiàn)出血、滲出物、炎癥細(xì)胞。

2.4 各組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達(dá)量比較NF-κB表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)和少部分細(xì)胞核，細(xì)胞核用蘇木精復(fù)染陰性為藍(lán)色，陽(yáng)性紫黑色。免疫組化半定量分析顯示，模型組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達(dá)量明顯高于正常組（P〈0.01）；蒙藥紹沙七味丸中劑量組和復(fù)方丹參片組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達(dá)量明顯低于模型組（P〈0.05），蒙藥紹沙七味丸低、高劑量組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達(dá)量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見(jiàn)表3）

表3 各組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達(dá)的平均光密度值比較（±s）

表3 各組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達(dá)的平均光密度值比較（±s）

注：與正常組比較，aP〈0.01；與模型組比較，bP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）NF-κB正常組 6 - 109.78±10.88模型組 6 - 173.19±14.20a蒙藥紹沙七味丸低劑量組6 0.80 162.10±11.37蒙藥紹沙七味丸中劑量組6 1.60 159.60±10.02b蒙藥紹沙七味丸高劑量組6 3.20 161.32±10.90復(fù)方丹參片組 6 0.25 161.39±9.58b

圖1 各組大鼠心臟組織病理切片圖（HE，×400）

3 討 論

心肌缺血損傷是一種復(fù)雜的病理過(guò)程，急性心肌梗死也是一種炎癥過(guò)程，而細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著非常重要的作用，炎癥反應(yīng)過(guò)度表達(dá)是心肌損傷的主要機(jī)制之一。IL-6和TNF-α為眾多炎癥細(xì)胞因子中比較特別的[7]，都是重要的炎癥介質(zhì)，當(dāng)心肌缺血發(fā)生時(shí)，可引起TNF-α、IL-6等促炎性細(xì)胞因子釋放，促使中性粒細(xì)胞向損傷區(qū)域聚集，組織浸潤(rùn)增加，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生大量自由基，加劇組織損傷[8-9]。IL-6在炎癥反應(yīng)中起核心調(diào)節(jié)作用，IL-6基因表達(dá)的多態(tài)性可影響機(jī)體炎癥、免疫反應(yīng)程度，與冠心病發(fā)病的易感性有關(guān)，是冠脈斑塊炎癥事件重要的局部和循環(huán)標(biāo)記物，被認(rèn)為是冠心病發(fā)病的重要候選基因之一[10]。TNF-α可引起腫瘤組織出血性壞死，是一種促炎性細(xì)胞因子，主要由激活的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)及生物學(xué)功能。在應(yīng)激狀態(tài)下，TNF-α在心肌大量表達(dá)，可以通過(guò)多種途徑影響心肌功能，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，并造成心肌損傷[11]。在各種心臟疾病如心肌缺血/再灌注損傷、缺血預(yù)處理、不穩(wěn)定型心絞痛、充血性心力衰竭、心肌炎及擴(kuò)張性心肌病等都存在NF-κB激活[12]。NF-κB通過(guò)對(duì)多種炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子、黏附分子等基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致心肌炎癥反應(yīng)，促發(fā)凋亡、壞死、心功能衰竭等，導(dǎo)致心肌缺血損傷，它的激活與抑制直接關(guān)系到炎癥損傷的進(jìn)展與預(yù)后[13]。心肌缺血時(shí)，TNF-α、IL-6往往共同發(fā)生作用，在激活的心肌組織細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子共同發(fā)揮強(qiáng)大的致炎作用，且通過(guò)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的功能。

蒙藥紹沙七味丸中廣棗中的黃酮類及有機(jī)酸等成分的存在使其具有多種生理活性，包括抗心律失常作用、保護(hù)缺血心肌作用、影響血液動(dòng)力學(xué)、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等生理活性[14]；原兒茶酸具有降低心肌耗氧量，提高心肌耐缺氧能力作用，可降低冠脈阻力，顯著縮小心肌梗死范圍[15]。野牦牛心（由于野牦牛為國(guó)家保護(hù)動(dòng)物，野牦牛心藥材稀缺，故多用牛心，兔心替代）富含的甘氨酸[16]、精氨酸[17]等均具有保護(hù)心臟、治療缺血性心臟病、改善心功能等作用。輔藥肉豆蔻揮發(fā)油可減慢心率，降低心律失常的發(fā)生率，同時(shí)降低心肌細(xì)胞損傷所釋放的GOT、CK、LDH的含量，降低MDA和升高SOD的活性，從而對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[18]。木香有效成分主要為萜類、生物堿、蒽醌、黃酮等，能保護(hù)心臟，治療缺血性心臟病。低濃度的木香揮發(fā)油對(duì)離體兔心有抑制作用。從木香揮發(fā)油中分離出的成分均能不同程度地抑制豚鼠、兔和蛙的離體心臟活動(dòng)[19]。阿魏具有保護(hù)心血管，以及增加心率的作用[20]。

本研究中，蒙藥紹沙七味丸各給藥組均可不同程度地降低冠狀動(dòng)脈結(jié)扎復(fù)制大鼠急性心肌缺血模型大鼠的血清CK-MB、LDH含量，并能不同程度地下調(diào)血清IL-6、TNF-α水平和心臟組織NF-κB蛋白的表達(dá)，從而改善心臟組織的病理改變。蒙藥紹沙七味丸對(duì)急性心肌缺血損傷有一定的保護(hù)作用，其中蒙藥紹沙七味丸中、高劑量組作用更佳，低劑量組作用其次。蒙藥紹沙七味丸的抗炎癥機(jī)制可能與IL-6、TNF-α炎癥因子水平與NF-κB蛋白的表達(dá)有關(guān)。

圖2 各組大鼠心臟組織NF-κB表達(dá)情況（免疫組化，×400）