徐晶晶，饒沁玲，鮑紅娟，馬啟文，徐紫嫚，向云亞

（1.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學(xué)院呼吸疾病研究所，福建 廈門 361023）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一種以慢性、頑固性咳嗽為主要或唯一臨床表現(xiàn)的特殊類型的哮喘，是引起成人及兒童慢性咳嗽的首位病因，約占1/3[1-2]。目前國內(nèi)外治療CVA的藥物主要包括吸入性糖皮質(zhì)激素（ICS）、支氣管擴張劑、白三烯受體拮抗劑等，但禁忌證、副作用和藥物成癮性導(dǎo)致臨床療效普遍不佳[3-4]。中醫(yī)藥歷代治咳、治哮喘的經(jīng)驗可為辨治CVA提供寶貴的借鑒?，F(xiàn)代臨床上麻杏石甘湯常被單獨或與其他藥物聯(lián)合使用，它治療CVA、支氣管哮喘、過敏性咳嗽、肺炎、上呼吸道感染等呼吸系統(tǒng)疾病，有著確切的療效。

麻杏石甘湯出自《傷寒論》，由麻黃、杏仁、石膏和炙甘草4味藥組成，具有辛涼宣肺、清熱平喘之功效，主治肺熱咳喘證。近年來，臨床發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯治療CVA療效顯著，麻杏石甘湯在臨床上單獨使用或配伍其他藥物治療CVA均有明顯效果[5-6]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，慢性咳嗽及哮喘等呼吸道疾病的發(fā)生與呼吸道內(nèi)TRPV1的表達異常及其介導(dǎo)的信號傳遞異常密切相關(guān)[7-8]。TRPV1通道在呼吸系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。本研究基于TRPV1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究麻杏石甘湯對CVA模型大鼠支氣管及肺中TRPV1及NK-1R表達的影響，為進一步探討其作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物60只SPF級健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量140～160 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。大鼠飼養(yǎng)于恒定的環(huán)境中，溫度保持在20～24℃，濕度為50%～70%。實驗經(jīng)廈門醫(yī)學(xué)院動物實驗倫理委員會審核通過。麻醉處死全部實驗大鼠，實驗過程中動物處理嚴格按照國家科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中的動物倫理學(xué)標準進行。

1.2 藥物 麻杏石甘湯（藥物組成：麻黃9 g，杏仁9 g，生石膏18 g，炙甘草6 g），飲片購自北京同仁堂（集團）有限責(zé)任公司。制備方法如下，麻黃、生石膏先煎，將麻黃、生石膏（布包煎）飲片加8倍藥物質(zhì)量的蒸餾水浸泡30 min后，煎煮15 min，再加入杏仁、炙甘草一起煎煮30 min，紗布粗濾取藥液；藥渣加6倍藥物質(zhì)量的水，煎煮30 min，紗布粗濾去渣，合并兩次藥液，旋蒸回收溶劑，濃縮至全方生藥量1.4 g/mL，4℃保存?zhèn)溆?。吸入用布地奈德混懸液（阿斯利康醫(yī)藥公司，批號：324166）。

1.3 試劑 卵清蛋白（OVA，美國Sigma公司，批號：SLBQ9036V）；天然辣椒堿（阿拉丁試劑上海有限公司，批號：L1807087）；氫氧化鋁（阿拉丁試劑上海有限公司，批號：H1813008）；大鼠降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）ELISA試劑盒（天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號：175190711）；大鼠P物質(zhì)（SP）ELISA試劑盒（天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號：534190711）；4%多聚甲醛（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：HP190703）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20190104）；蛋白預(yù)染Marker（美國Thermo Fisher公司，批號：00677289）；TRPV1抗體（批號：ab6166）、NK-1R抗體（批號：ab131091）（abcam公司）；HRP標記的山羊抗兔抗體（ABclonal公司，批號：9300014001）；ECL發(fā)光檢測試劑盒（上海天能科技有限公司，批號：180-5001）。

1.4 主要儀器5417R臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；KZ-Ⅱ高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Multiskan GO全波長酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；403M超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；小動物霧化箱（50 cm×40 cm×30 cm）；TX-110X50水浴搖床（上海天呈實驗儀器有限公司）；Smart2Pure純水機（美國Thermo Fisher公司）；N-1200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；DZF電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；YLS-8A多功能誘咳引喘儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）；EPS600電泳儀、VE180微型垂直電泳槽、VE186轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司）；ChemiDoc TM XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.5 造模與分組 將60只健康Wistar大鼠用簡單隨機分組法分為正常對照組，模型對照組，布地奈德組及麻杏石甘湯高、中、低劑量組，每組10只。除正常對照組外，其余各組大鼠采用OVA和Al（OH）3激發(fā)致敏，并用OVA霧化激發(fā)來建立CVA大鼠模型[9-11]，大鼠于造模第1、8天腹腔注射1 mL抗原液[含OVA、Al（OH）3各100 mg]致敏。并于15 d后將各組大鼠分別置于小動物霧化箱內(nèi)，每日上午用含1% OVA的生理鹽水溶液超聲霧化激發(fā)20 min，共15 d，以激發(fā)哮喘。當(dāng)大鼠出現(xiàn)腹肌明顯收縮，呼吸加深、加快等呼吸道痙攣癥狀，提示CVA大鼠造模成功[12]。

1.6 實驗給藥 于造模第15天開始給藥，各給藥組大鼠均于OVA霧化激發(fā)前30 min給藥干預(yù)，共治療15 d。給藥組劑量換算以成人臨床用藥劑量為依據(jù)，再根據(jù)人與大鼠體表面積換算比進行折算。麻杏石甘湯高、中、低劑量組大鼠分別灌胃給予7、3.5、1.75 g/kg麻杏石甘湯，給藥體積1 mL/100 g，布地奈德組大鼠給予布地奈德霧化吸入，0.33 mg/kg。正常對照組和模型對照組大鼠均用的蒸餾水灌胃，1 mL/100 g。

1.7 觀察指標

1.7.1 一般體征觀察 觀察造模后各組大鼠的皮毛、活動、飲食及體質(zhì)量等一般體征的變化情況，同時觀察其咳嗽、喘息等癥狀變化。

1.7.2 咳嗽次數(shù)觀察 采用辣椒素激發(fā)法比較各組大鼠的氣道敏感性[13]。于實驗第30天，末次給藥后30 min，將大鼠放入誘咳引喘儀的霧化盒內(nèi)，霧化吸入1×10-4mol/L辣椒素溶液60 s，立即停止刺激，再在盒內(nèi)停留60 s，記錄2 min內(nèi)各組大鼠的咳嗽次數(shù)。

1.7.3 大鼠肺、支氣管病理組織形態(tài)學(xué)觀察 大鼠麻醉后處死，迅速取出右肺組織，用冰生理鹽水沖洗，濾紙擦干，右肺中葉置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，HE染色后，鏡下觀察其支氣管、肺組織的病理學(xué)改變。

1.7.4 ELISA法檢測大鼠肺組織中CGRP、SP的含量 將超低溫冰箱中保存的肺組織取出，稱取100 mg放入EP管中，加入1 mL冷PBS，用眼科剪將組織快速剪碎后用高速組織研磨儀研磨90 s，4℃下3 000 r/min離心15 min，取上清液嚴格按照試劑盒說明書測定。

1.7.5 Western blotting檢測大鼠氣管中TRPV1蛋白及肺組織中NK-1R的表達 將超低溫冰箱中保存的各組大鼠氣管、肺組織取出，每組選6個樣品分別按比例加入預(yù)冷的裂解液后，用眼科剪將組織快速剪碎后用高速組織研磨儀研磨90 s，4℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液，加入上樣緩沖液后煮沸變性。每孔加樣后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉處理1.5 h，分別加入一抗TRPV1、NK-1R、GAPDH（1∶2 000）孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌后，加入適量ECL試劑于化學(xué)發(fā)光儀成像，采用Image J圖像分析軟件對圖像進行信號分析，計算目的蛋白/GAPDH蛋白比值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，以P〈0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 麻杏石甘湯對CVA大鼠一般體征的影響 造模前，各組大鼠行動靈活，反應(yīng)敏捷，毛色光澤，體質(zhì)量等情況基本一致。模型對照組、布地奈德組及麻杏石甘湯高、中、低劑量組大鼠在腹腔注射OVA后出現(xiàn)活動減少，拱背蜷縮等表現(xiàn)；在用OVA霧化激發(fā)后，模型對照組，布地奈德組及麻杏石甘湯高、中、低劑量組大鼠均出現(xiàn)躁動不安、撓鼻、打噴嚏、呼吸急促等癥狀，并且可見其皮毛失去光澤，體質(zhì)量增長緩慢，模型對照組中1只大鼠體質(zhì)量減輕，在造模期間死亡。經(jīng)藥物治療后，各給藥組大鼠在實驗結(jié)束時一般狀態(tài)較模型對照組好。

2.2 各組大鼠咳嗽次數(shù)比較 模型對照組大鼠咳嗽次數(shù)明顯多于正常對照組（P〈0.01）；布地奈德組及麻杏石甘湯高、中、低劑量組大鼠咳嗽次數(shù)均明顯少于模型對照組（P〈0.01）；麻杏石甘湯中、高劑量組及布地奈德組大鼠咳嗽次數(shù)均少于麻杏石甘湯低劑量組（P〈0.01）；麻杏石甘湯中、高劑量組大鼠咳嗽次數(shù)與布地奈德組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P〉0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠咳嗽次數(shù)比較（±s，次）

表1 各組大鼠咳嗽次數(shù)比較（±s，次）

注：與正常對照組比較，aP〈0.01；與模型對照組比較，bP〈0.01；與麻杏石甘湯低劑量組比較，cP〈0.01

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）咳嗽次數(shù)正常對照組 10 - 2.70±1.06模型對照組 10 - 6.60±1.26a布地奈德組 9 0.33×10-3 3.11±1.05bc麻杏石甘湯低劑量組 10 1.75 5.10±1.37b麻杏石甘湯中劑量組 10 3.50 3.40±1.07bc麻杏石甘湯高劑量組 10 7.00 3.00±1.15bc

2.3 各組大鼠肺、支氣管病理組織形態(tài)學(xué)改變 正常對照組大鼠支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)正常，支氣管管壁及平滑肌厚度正常，支氣管上皮細胞完整，肺泡腔內(nèi)清潔無滲出，未見炎癥細胞浸潤。模型對照組大鼠支氣管管腔狹窄，黏膜增厚，支氣管周圍血管擴張、充血，肺泡腔增大，肺泡間隔及氣道平滑肌明顯增厚，可見明顯淋巴濾泡及纖維組織增生，有大量的炎癥細胞浸潤。布地奈德組及麻杏石甘湯高、中、低劑量組大鼠肺及支氣管組織病理變化明顯減輕，無淋巴濾泡，肺泡間隙稍增厚，炎癥細胞浸潤較模型對照組減輕。布地奈德組、麻杏石甘湯高劑量組病理改善更明顯。（見圖1）

圖1 各組大鼠肺、支氣管組織病理變化（HE，×100）

2.4 各組大鼠肺組織CGRP、SP含量比較 模型對照組大鼠肺組織中神經(jīng)肽類物質(zhì)CGRP、SP含量明顯高于正常對照組（P〈0.01）；麻杏石甘湯中、高劑量組及布地奈德組大鼠肺組織中CGRP、SP含量明顯低于模型對照組（P〈0.01）；麻杏石甘湯中劑量組大鼠肺組織中CGRP含量低于麻杏石甘湯低劑量組（P〈0.05）；麻杏石甘湯中、高劑量組大鼠肺組織中，CGRP、SP含量與布地奈德組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P〉0.05）。（見表1）

表2 各組大鼠肺組織CGRP、SP含量比較（±s，pg/mg）

表2 各組大鼠肺組織CGRP、SP含量比較（±s，pg/mg）

注：與正常對照組比較，aP〈0.01；與模型對照組比較，bP〈0.01；與麻杏石甘湯低劑量組比較，cP〈0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg） CGRP SP正常對照組 10 - 26.16±2.31 19.70±2.08模型對照組 10 - 30.12±2.82a 22.89±1.46a布地奈德組 9 0.33×10-3 26.84±1.98b 19.25±1.80b麻杏石甘湯低劑量組10 1.75 28.68±2.13 21.18±2.11麻杏石甘湯中劑量組10 3.50 25.86±2.36bc 19.25±2.73b麻杏石甘湯高劑量組10 7.00 26.74±2.29b 19.21±3.01b

2.5 各組大鼠氣管中TRPV1蛋白及肺組織中NK-1R蛋白表達比較 模型對照組大鼠氣管中TRPV1蛋白及肺組織中NK-1R蛋白表達高于正常對照組（P〈0.01）；麻杏石甘湯高劑量組及布地奈德組大鼠氣管中TRPV1蛋白及肺組織中NK-1R蛋白表達低于模型對照組（P〈0.05或P〈0.01)；麻杏石甘湯中劑量組大鼠氣管中TRPV1蛋白低于模型對照組（P〈0.05)；麻杏石甘湯低、中、高劑量組大鼠氣管中TRPV1蛋白及肺組織中NK-1R蛋白表達和布地奈德組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P〉0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠氣管中TRPV1蛋白及肺組織中NK-1R蛋白表達比較（±s，n=6）

3 討 論

CVA患者的臨床表現(xiàn)為慢性、頑固性咳嗽，易受冷熱刺激及煙霧異味的影響而加重病情，是支氣管哮喘的一種特殊類型。其病理生理改變與哮喘相似，即有氣道高敏感性，且具持續(xù)性、慢性氣道炎癥反應(yīng)[14-15]。氣道高敏感性是引發(fā)CVA的重要原因。氣道高敏感性與TRPV1的興奮性增加和表達量多少有著密切聯(lián)系[16]。CVA病程中氣道炎癥引起的病理改變可在局部形成一個低pH和中熱的環(huán)境，誘導(dǎo)TRPV1的表達增加而形成咳嗽高敏感性。另一方面TRPV1的表達增加可誘導(dǎo)釋放多種神經(jīng)肽，加重氣道神經(jīng)源性炎癥[17]。

TRPV1受體也稱辣椒素受體，幾乎表達于整個呼吸系統(tǒng)，從上氣道到下氣道，直至肺泡，外源性刺激物或內(nèi)源性炎癥因子可直接激活TRPV1或間接影響TRPV1的表達，TRPV1通道被激活后沿神經(jīng)傳導(dǎo)通路可引起咳嗽反射[18-20]。TRPV1通道激活所導(dǎo)致的Ca2+內(nèi)流可觸發(fā)外周和中樞神經(jīng)末梢的神經(jīng)肽如速激肽（SP）和降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的釋放。這些神經(jīng)肽可導(dǎo)致支氣管收縮、蛋白分泌、氣管黏膜水腫和炎癥細胞趨化。其經(jīng)歷了“外源性刺激物→TRPV1活化→感覺神經(jīng)元Ca2+內(nèi)流→SP和CGRP釋放→NKR（NKR：速激肽受體）分子活化”的信號傳遞過程[21]。

根據(jù)CVA的主要臨床表現(xiàn)，有學(xué)者認為其屬于中醫(yī)學(xué)“咳嗽”范疇，也有學(xué)者認為其屬于中醫(yī)學(xué)“哮病”范疇，還有學(xué)者認為“逆咳”較符合本病的特點[22]。麻杏石甘湯出自《傷寒論》，主治肺熱咳喘證?，F(xiàn)代臨床上麻杏石甘湯常被單獨或與其他藥物聯(lián)用，治療CVA、支氣管哮喘、過敏性咳嗽等呼吸系統(tǒng)疾病[23]。目前關(guān)于麻杏石甘湯治療CVA具體機制的研究仍較為局限。本研究初步探討了麻杏石甘湯對CVA模型大鼠的改善作用及作用機理。

本研究結(jié)果顯示，在接受OVA激發(fā)后，除正常對照組外，其余各組大鼠均出現(xiàn)躁動不安、撓鼻、打噴嚏、呼吸急促等癥狀；且在接受辣椒素刺激后，與正常對照組比較，模型對照組大鼠咳嗽次數(shù)明顯增加，結(jié)合病理結(jié)果均提示CVA模型復(fù)制成功。經(jīng)藥物治療后，布地奈德組及麻杏石甘湯高、中、低劑量組大鼠在實驗結(jié)束時一般狀態(tài)較模型對照組好且咳嗽次數(shù)明顯減少；與模型對照組比較，布地奈德組及麻杏石甘湯高、中、低劑量組大鼠肺及支氣管組織病理變化明顯減輕，肺組織中CGRP、SP含量明顯降低，大鼠氣管中TRPV1蛋白及肺組織中NK-1R蛋白表達明顯降低。

綜上所述，麻杏石甘湯可能是通過抑制TRPV1的表達，從而抑制感覺神經(jīng)肽的釋放，降低氣道敏感性及改善氣道炎癥等途徑來發(fā)揮對CVA模型大鼠的治療作用。但麻杏石甘湯是通過何種途徑調(diào)控TRPV1的分布與表達，尚需進一步的研究。