劉雨昕，王國(guó)華

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029）

子宮腺肌?。╝denomyosis，ADS）是子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)侵入子宮肌層，伴周圍肌層細(xì)胞的代償性肥大和增生的一種良性病變[1]。ADS的發(fā)生與發(fā)展和子宮平滑肌的異常收縮有密切關(guān)系[2]。研究發(fā)現(xiàn)，ADS患者的病灶局部存在子宮內(nèi)膜與肌層交界區(qū)（endometrial-myometrial interface，EMI）的微損傷，為修復(fù)組織的微損傷，病灶局部的高雌激素狀態(tài)無(wú)法解除，子宮蠕動(dòng)增強(qiáng)，反復(fù)損傷EMI，周圍組織微創(chuàng)傷和子宮內(nèi)膜內(nèi)陷不斷加重，最終導(dǎo)致ADS的侵襲性進(jìn)展，這一機(jī)制即ADS的組織損傷與修復(fù)機(jī)制（tissue injury and repair，TIAR）。而在TIAR過(guò)程中關(guān)鍵的RhoA/ROCK信號(hào)通路是一種鈣離子（Ca2+）非依賴性的平滑肌收縮調(diào)節(jié)機(jī)制，這一機(jī)制通過(guò)Rho家族中的RhoA基因激活下游的Rho相關(guān)激酶（Rho-associated kinase，ROCK）和磷酸化肌球蛋白輕鏈（phosphorylated myosin light chain，p-MLC），對(duì)ADS的細(xì)胞形態(tài)學(xué)有重要影響，并在ADS發(fā)生發(fā)展的多種生物學(xué)過(guò)程如細(xì)胞收縮、黏附和增殖中均發(fā)揮重要作用[3]。已有研究證實(shí)，ADS患者中醫(yī)證候共同特點(diǎn)為存在“瘀血”[4-5]，而應(yīng)用具有活血化瘀功效[6]的桂枝茯苓丸治療ADS可有效改善患者疼痛癥狀，降低血清癌抗原125（cancer antigen-125，CA-125）水平，降低異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲力，調(diào)節(jié)ADS病灶局部基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metallopeptidase 2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-7（matrix metallopeptidase 7，MMP-7）蛋白表達(dá)水平[7]，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。本研究將桂枝茯苓丸應(yīng)用于美國(guó)癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠ADS模型，以明確桂枝茯苓丸對(duì)模型小鼠RhoA/ROCK信號(hào)通路相關(guān)分子的影響，從而為桂枝茯苓丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物90只健康的無(wú)特定病原體（specific pathogen free,SPF）級(jí)雌性ICR小鼠，鼠齡1日齡（設(shè)小鼠出生日為1日齡），體質(zhì)量1.8～2.4 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室，飼養(yǎng)溫度18～24℃，相對(duì)濕度40%～60%，每天光照12 h，小鼠1～21日齡均由母鼠哺乳喂養(yǎng)，22日齡起與母鼠分籠，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前母鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)所有小鼠以丙泊芬（10 mg/kg）尾靜脈麻醉后，取材處死。本研究全部?jī)?nèi)容遵循《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)郝?tīng)栃粱浴?，所有小鼠均接受人道護(hù)理及處死方式。

1.2 藥物與試劑 桂枝茯苓丸顆粒劑由桂枝、茯苓、赤芍、桃仁、牡丹皮共5味中藥各等量配伍（北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，批號(hào)：20190905）；蘇木精（批號(hào)：20190324）、伊紅（批號(hào)：20190328）；總RNA提取試劑盒（批號(hào)：20200108）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：202000203）（北京天根生化科技有限公司）；RhoA、ROCK1、ROCK2熒光定量PCR試劑盒（美國(guó)西格瑪奧德里奇公司，批號(hào)：20200224）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）熒光定量PCR試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20200201）；兔抗鼠p-MLC多克隆抗體（批號(hào)：20200121）、兔抗β肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號(hào)：20200121）（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）；RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA引物序列（北京締威樂(lè)生物科技有限公司，批號(hào)：20200227）。

1.3 主要儀器WTB 200型電子天平（波蘭瑞戈威公司）；85-2恒溫磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器廠）；EG1160型石蠟包埋機(jī)（德國(guó)萊卡公司）；KM2135型石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）；DP71數(shù)碼相機(jī)（日本奧林巴斯公司）；BX51型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；QuantStudio 5型定量PCR儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；DYY-2C型SDS-PAGE電泳儀（北京六一儀器廠）；1-15K型冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)西格瑪奧德里奇公司）。

1.4 造模與分組 經(jīng)文獻(xiàn)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)作用于RhoA/ROCK信號(hào)通路治療ADS的良好對(duì)照藥物，故不設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組，僅設(shè)立生理鹽水灌胃作空白對(duì)照組。通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法，將90只雌性小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型組，桂枝茯苓丸高、中、低劑量組，每組18只。除空白對(duì)照組外，其余小鼠依照參考文獻(xiàn)[8]，采用滴喂他莫昔芬法建立ICR小鼠ADS模型，于小鼠出生后第2～5天，滴喂5μL/g體積比為2∶0.2∶3的煉乳/卵磷脂/花生油混合液+2.7μmol/kg他莫昔芬，1次/d?？瞻讓?duì)照組小鼠于出生后第2～5天，每天滴喂5μL/g的生理鹽水。于小鼠49日齡，各組以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取2只小鼠，以丙泊芬（10 mg/kg）尾靜脈麻醉處死，取部分子宮組織置于4%多聚甲醛中固定48 h備用。對(duì)子宮組織逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明后浸蠟并包埋，蠟塊5μm厚度連續(xù)切片，以蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色并封片，在配有數(shù)碼相機(jī)的光學(xué)顯微鏡下觀察子宮肌層內(nèi)膜組織浸潤(rùn)情況并拍照，見(jiàn)空白對(duì)照組小鼠子宮肌層形態(tài)完整，未見(jiàn)明顯腺體或間質(zhì)浸潤(rùn)；模型組和桂枝茯苓丸高、中、低劑量組小鼠子宮肌層內(nèi)有大量子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)浸潤(rùn)，并伴有部分腺體腫脹、子宮內(nèi)膜增生。提示小鼠ADS造模成功。（見(jiàn)圖1）

圖1 ICR小鼠子宮HE染色（×100）

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 分別取一定量的桂枝茯苓丸顆粒劑，用生理鹽水配制成高、中、低劑量桂枝茯苓丸溶液，磁力攪拌器50℃攪拌10 min后灌胃。于小鼠50日齡起，每日10:00:00，桂枝茯苓丸高、中、低劑量組小鼠分別灌胃給予高、中、低劑量[8.64、4.32、2.16 g生藥/（kg·d）]的桂枝茯苓丸溶液，空白對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，5μL/g；1次/d，共灌胃30 d。

1.6 觀察指標(biāo) 于各組小鼠灌胃結(jié)束后1 d，每組以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取12只小鼠，稱體質(zhì)量并記錄，以丙泊芬（10 mg/kg）尾靜脈麻醉處死，取子宮組織共12份，其中6份置于4%多聚甲醛中固定48 h備用，另6份液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.1 小鼠子宮組織HE染色 組織切片及HE染色步驟同“1.4”。切片染色結(jié)果以雙盲法由兩名副主任醫(yī)師職稱以上的病理醫(yī)師判定，于高倍鏡下選擇2個(gè)視野的組織部位，按照小鼠子宮組織內(nèi)膜腺體及間質(zhì)浸潤(rùn)程度分為4度。0度：無(wú)明顯浸潤(rùn)，肌層形態(tài)完整；1度：輕度浸潤(rùn)，間質(zhì)或上皮細(xì)胞浸潤(rùn)至內(nèi)膜基底層界面下，未超過(guò)淺肌層內(nèi)1/2；2度：中度浸潤(rùn)，間質(zhì)及上皮細(xì)胞浸潤(rùn)至淺肌層外1/2；3度：重度浸潤(rùn)，間質(zhì)及上皮細(xì)胞浸潤(rùn)至深肌層或漿膜下。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)小鼠子宮組織RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA的表達(dá) 采用總RNA提取試劑進(jìn)行樣本RNA提取，把小鼠子宮組織放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄采用博友順?lè)崔D(zhuǎn)錄試劑盒方法，10×g DNA Eraser Buffer 1μL，gDNA Eraser 0.5μL，RNA Template 300 ng，RNase-Free Water 10μL，42℃溫浴5 min去除基因組DNA，200 U/μL HiFiScript 1μL，Oligo-dT Primer 1μL，5×ScriptRT Buffer 4μL，RNase-Free Water 4μL，42℃溫浴20 min，85℃溫浴5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用qPCR法檢測(cè)RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA的表達(dá)，反應(yīng)體系為10μL：2×SG Green qPCR Mix 5μL，F(xiàn)orward Primer（10μmol/L）0.2μL，Reverse Primer（10μmol/L）0.2μL，cDNA 1μL，Water（nuclease-free）3.6μL。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)混合均勻，離心，分到96孔PCR板里，每個(gè)樣品每個(gè)基因3個(gè)PCR平行反應(yīng)。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸20 s，反應(yīng)進(jìn)行共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線繪制：95℃15 s，60℃60 s，85℃15 s，60℃15 s。采用2-△△ct方法分析數(shù)據(jù)。引物設(shè)計(jì)由NCBI-Nucleotide基因庫(kù)檢索后，使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.6.3 Western blotting檢測(cè)小鼠子宮組織磷酸化肌球蛋白輕鏈（p-MLC）表達(dá) 取小鼠子宮組織置于緩沖液中，低溫勻漿后離心提取小鼠子宮總蛋白，Loary法蛋白定量。8%SDS聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠中電泳2 h，轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過(guò)的聚偏氟乙烯（PVDF）膜，牛奶封閉2 h，加入兔抗鼠p-MLC、兔抗β-actin標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參一抗（1∶2 000），4℃孵育過(guò)夜；Tris Buffered Saline with Tween（TBST）緩沖液洗膜40 min后，加入二抗（1∶10 000），孵育1 h，TBST洗膜40 min，顯色壓片后使用Image J軟件分析條帶的光密度值，每個(gè)條帶重復(fù)測(cè)量3次。p-MLC的相對(duì)表達(dá)=p-MLC光密度值/內(nèi)參β-actin光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)方差齊性，若方差齊性，則進(jìn)一步采用Bonferroni法行兩兩比較；等級(jí)資料比較采用Kruska-Wallis H秩和檢驗(yàn)，若Kruska-Wallis H秩和檢驗(yàn)呈現(xiàn)出顯著性（P〈0.05），進(jìn)一步采用Nemenyi法檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠樣本脫落情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共有9只小鼠死亡。動(dòng)物模型的建立過(guò)程中，空白對(duì)照組死亡1只，模型組死亡2只，桂枝茯苓丸中劑量組死亡2只，桂枝茯苓丸低劑量組死亡1只；灌胃給藥過(guò)程中，桂枝茯苓丸高劑量組死亡2只，桂枝茯苓丸中劑量組死亡1只。取材時(shí)桂枝茯苓丸中劑量組小鼠樣本量最少，為12只小鼠，為平衡組間樣本量，其余各組小鼠均取按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)取12只小鼠處死取材作指標(biāo)觀察。各組取材的12只小鼠中，6只行HE染色，6只行實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白印跡檢測(cè)。

2.2 各組小鼠子宮組織病理學(xué)改變情況 空白對(duì)照組小鼠子宮肌層形態(tài)完整，無(wú)明顯內(nèi)膜腺體浸潤(rùn)；模型組小鼠子宮肌層中的異位子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)浸潤(rùn)程度較深，間質(zhì)及上皮細(xì)胞浸潤(rùn)至深肌層或漿膜下；桂枝茯苓丸高、中劑量組小鼠子宮肌層中的異位子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)浸潤(rùn)位于深肌層至淺肌層之間；桂枝茯苓丸低劑量組小鼠子宮肌層中的異位子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)浸潤(rùn)程度較模型組輕，間質(zhì)及上皮細(xì)胞浸潤(rùn)至淺肌層外。（見(jiàn)圖2）

圖2 各組小鼠子宮組織病理圖（HE，×100）

5組小鼠子宮內(nèi)膜潤(rùn)程度分級(jí)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=23.257，P〈0.01）。模型組小鼠子宮內(nèi)膜浸潤(rùn)程度分級(jí)明顯高于空白對(duì)照組（P〈0.01）；桂枝茯苓丸高、中劑量組小鼠子宮內(nèi)膜浸潤(rùn)程度分級(jí)明顯高于空白對(duì)照組（P〈0.05）；桂枝茯苓丸低劑量組小鼠子宮內(nèi)膜浸潤(rùn)程度分級(jí)與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；桂枝茯苓丸高、中、低劑量組小鼠子宮內(nèi)膜浸潤(rùn)程度分級(jí)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；桂枝茯苓丸高、中劑量組小鼠子宮內(nèi)膜浸潤(rùn)程度分級(jí)與桂枝茯苓丸低劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 各組小鼠子宮肌層子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)浸潤(rùn)程度分級(jí)比較（只）

2.3 各組小鼠子宮組織RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 模型組小鼠子宮組織中RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組（P〈0.01或P〈0.05），ROCK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；桂枝茯苓丸低、高劑量組小鼠子宮組織中RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型組（P〈0.01或P〈0.05），ROCK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；桂枝茯苓丸中劑量組小鼠子宮組織中RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；桂枝茯苓丸高劑量組小鼠子宮組織中RhoA mRNA、ROCK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于桂枝茯苓丸低劑量組（P〈0.01）。（見(jiàn)表3）

表3 各組小鼠子宮組織RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組小鼠子宮組織RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP〈0.05，bP〈0.01；與模型組比較，cP〈0.05，dP〈0.01；與桂枝茯苓丸高劑量組比較，eP〈0.05，fP〈0.01

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）RhoA mRNA ROCK1 mRNA ROCK2 mRNA空白對(duì)照組 6 - 0.018 2±0.019 4 0.003 6±0.003 2 0.020 8±0.010 6模型組 6 - 0.041 0±0.033 4a 0.006 3±0.004 4a 0.028 0±0.011 2桂枝茯苓丸高劑量組6 8.64 0.007 0±0.006 7ad 0.002 4±0.002 0d 0.014 1±0.005 2a桂枝茯苓丸中劑量組6 4.32 0.033 9±0.035 6f 0.006 3±0.005 8e 0.026 6±0.140 3桂枝茯苓丸低劑量組6 2.16 0.020 0±0.010 3cf 0.003 3±0.002 3c 0.020 9±0.006 9f

2.4 各組小鼠子宮組織p-MLC蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 模型組小鼠子宮組織中p-MLC蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組（P〈0.05）；桂枝茯苓丸高、低劑量組小鼠子宮組織中p-MLC蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型組（P〈0.01或P〈0.05）；桂枝茯苓丸低劑量組小鼠子宮組織中p-MLC蛋白相對(duì)表達(dá)量高于桂枝茯苓丸高劑量組（P〈0.05）；桂枝茯苓丸中劑量組小鼠子宮組織中p-MLC蛋白相對(duì)表達(dá)量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見(jiàn)圖3、表4）

圖3 各組小鼠子宮組織p-MLC蛋白表達(dá)圖譜

表4 各組小鼠子宮組織p-MLC蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 各組小鼠子宮組織p-MLC蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05，cP〈0.01；與桂枝茯苓丸高劑量組比較，dP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）給藥p-MLC空白對(duì)照組 6 - 0.852 5±0.068 5模型組 6 - 1.091 2±0.063 7a桂枝茯苓丸高劑量組6 8.64 0.600 9±0.128 1c桂枝茯苓丸中劑量組6 4.32 0.877 8±0.119 2d桂枝茯苓丸低劑量組6 2.16 0.813 8±0.076 5bd

3 討 論

西醫(yī)將ADS的治療歸屬于婦科子宮內(nèi)膜異位性疾病范疇，認(rèn)為ADS發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，且部分患者在疾病初期難以明確診斷而無(wú)法得到早期干預(yù)。ADS的主要癥狀為逐漸加重的進(jìn)行性痛經(jīng)，伴有月經(jīng)量增多、經(jīng)期延長(zhǎng)，更與不孕密切相關(guān)[9]。相關(guān)研究表明，ADS可降低育齡女性的生育能力，增加妊娠婦女發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎膜早破等不良產(chǎn)科結(jié)局的概率[10]，嚴(yán)重影響患者的身心健康與生活質(zhì)量。因此，對(duì)于ADS的發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究受到了人們的廣泛關(guān)注。

在ADS發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究中，子宮內(nèi)膜肌層交界區(qū)（endometrial-myometrial interface，EMI）作為子宮特有的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，在ADS的發(fā)病中起到重要作用。EMI由子宮內(nèi)1/3肌層與子宮基底層內(nèi)膜構(gòu)成，是阻止子宮內(nèi)膜侵入生長(zhǎng)于子宮肌層的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，存在宮腔手術(shù)操作史的女性ADS發(fā)病率為無(wú)宮腔手術(shù)操作史的女性的1.5倍[11]，診斷性刮宮、人工流產(chǎn)、剖宮產(chǎn)、放置宮內(nèi)節(jié)育器等手術(shù)操作會(huì)引起EMI損傷，進(jìn)而導(dǎo)致EMI局部雌激素濃度升高，以促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增殖與修復(fù)。然而，EMI局部的高雌激素狀態(tài)會(huì)激活RhoA/ROCK信號(hào)通路。RhoA/ROCK信號(hào)通路是一種Ca2+非依賴性的平滑肌收縮調(diào)節(jié)機(jī)制，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞收縮、黏附和增殖等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3]，與子宮平滑肌的異常收縮有密切關(guān)系。RhoA基因通過(guò)介導(dǎo)下游的ROCK1蛋白信號(hào)分子，增加效應(yīng)分子磷酸化肌球蛋白輕鏈（p-MLC）的表達(dá)，從而激活肌球蛋白頭部Mg2+-ATP酶，通過(guò)ATP的水解產(chǎn)生能量，進(jìn)而使肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白相互作用，引發(fā)平滑肌收縮，子宮蠕動(dòng)增強(qiáng)，EMI反復(fù)損傷，周圍組織微創(chuàng)傷和子宮內(nèi)膜內(nèi)陷不斷加重，局部高雌激素狀態(tài)無(wú)法解除，ADS的TIAR機(jī)制啟動(dòng)，最終導(dǎo)致ADS的侵襲性進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠子宮組織內(nèi)膜浸潤(rùn)程度分級(jí)，RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及RhoA/ROCK信號(hào)通路下游效應(yīng)分子p-MLC的蛋白表達(dá)量均高于空白對(duì)照組（P〈0.05）。而桂枝茯苓丸低劑量組小鼠子宮組織內(nèi)膜浸潤(rùn)程度分級(jí)，RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及p-MLC的蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。這與現(xiàn)有的針對(duì)子宮腺肌病RhoA/ROCK信號(hào)通路的相關(guān)研究結(jié)果一致[1-3]，驗(yàn)證了RhoA/ROCK信號(hào)通路在ADS的發(fā)病與進(jìn)展中起到了重要作用，且其發(fā)揮效應(yīng)主要通過(guò)上調(diào)ROCK1基因的表達(dá)，而與ROCK2基因無(wú)關(guān)[12]。

中醫(yī)學(xué)中無(wú)ADS病名，但根據(jù)ADS癥狀可將其歸屬于“癥瘕”“痛經(jīng)”“月經(jīng)過(guò)多”“經(jīng)期延長(zhǎng)”等范疇。本病病位在下焦胞中，基本病機(jī)為瘀血阻滯沖任、胞宮[13]，病因多為感受外邪、情志內(nèi)傷或手術(shù)損傷等因素導(dǎo)致臟腑功能失常、氣血失和、沖任失調(diào)，經(jīng)血不循常道，留于下腹而為瘀[14-15]。古代醫(yī)家認(rèn)為氣滯瘀血不化，發(fā)為癥瘕為本病的基本病機(jī)，如《景岳全書(shū)·婦人規(guī)》：“瘀血留滯作癥，惟婦人有之，然血必由氣，氣行則血行?！盵16]這也與現(xiàn)代醫(yī)家對(duì)本病的病機(jī)認(rèn)識(shí)相吻合。針對(duì)子宮腺肌病患者的中醫(yī)證候與體質(zhì)分布情況的相關(guān)研究顯示，子宮腺肌病患者中醫(yī)證候共同特點(diǎn)為存在“瘀血”，而其中醫(yī)體質(zhì)以“氣郁質(zhì)”為主[5]。韓竹林[17]應(yīng)用聚類分析方法對(duì)ADS的中醫(yī)證型進(jìn)行分析顯示，ADS證型中血瘀證最多，占70.59%?？梢?jiàn)，ADS的核心病機(jī)為“瘀血內(nèi)停”。本研究使用的桂枝茯苓丸源自《金匱要略》的經(jīng)典名方，相關(guān)原文論述為：“婦人宿有癥病，經(jīng)斷未及三月，而得漏下不止，胎動(dòng)在臍上者，為癥痼害?！盵18]提出應(yīng)用桂枝茯苓丸以治療癥瘕。桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、赤芍、桃仁、牡丹皮共5味藥各等量研末，煉蜜為丸而成，其中桂枝味辛、甘，性溫，溫通經(jīng)脈而行瘀血；素有癥瘕，血瘀日久多化熱，故配伍味苦，性微寒的牡丹皮、赤芍，與辛溫之桂枝相輔相成，可在清熱活血的同時(shí)使本方性味更為平和；桃仁味苦、甘，性平，配伍前藥增強(qiáng)活血祛瘀之效；茯苓味甘、淡，性平，滲利下行而益心脾之氣，既有助于行瘀血，又防行血太過(guò)傷正；上藥又以白蜜和丸，取緩和諸藥逐瘀藥力之意，使本方可長(zhǎng)期服用，以達(dá)到活血化瘀、緩消癥塊之功。桂枝茯苓丸中、高劑量組小鼠子宮組織內(nèi)膜浸潤(rùn)程度分級(jí)明顯高于空白對(duì)照組（P〈0.05），但與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；桂枝茯苓丸低劑量組小鼠子宮組織內(nèi)膜浸潤(rùn)程度分級(jí)與空白對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。與現(xiàn)有關(guān)于桂枝茯苓丸對(duì)ADS療效的相關(guān)研究結(jié)果相符[19]，驗(yàn)證了桂枝茯苓丸對(duì)ICR小鼠子宮腺肌病有治療作用。

綜上所述，桂枝茯苓丸對(duì)ICR小鼠子宮腺肌病的治療作用確切。本研究結(jié)果顯示，桂枝茯苓丸低劑量組小鼠子宮組織RhoAmRNA、ROCK1mRNA相對(duì)表達(dá)量及p-MLC蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組（P〈0.05）；而桂枝茯苓丸低劑量組小鼠子宮組織內(nèi)膜浸潤(rùn)程度、RhoAmRNA、ROCK1mRNA相對(duì)表達(dá)量、p-MLC蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。桂枝茯苓丸高劑量組小鼠子宮組織中RhoAmRNA、ROCK1mRNA表達(dá)、p-MLC的蛋白表達(dá)量均低于空白對(duì)照組比較（P〈0.05或P〈0.01），而子宮內(nèi)膜浸潤(rùn)程度分級(jí)高于空白對(duì)照組（P〈0.05），表明RhoA/ROCK信號(hào)通路的正常表達(dá)，從而介導(dǎo)下游肌動(dòng)蛋白的正常表達(dá)，是阻止ADS內(nèi)陷內(nèi)膜侵襲，從而治療ADS的關(guān)鍵[13]。適宜劑量的桂枝茯苓丸可能通過(guò)將RhoA/ROCK信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)調(diào)節(jié)至正常水平，從而在ICR小鼠子宮腺肌病的治療中發(fā)揮作用；而劑量過(guò)高的桂枝茯苓丸反而會(huì)抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路表達(dá)，降低其治療ADS的效果。但需要注意的是，本研究并未對(duì)ADS小鼠RhoA/ROCK信號(hào)通路進(jìn)行阻斷以對(duì)照處理，且目前尚無(wú)已明確作用于RhoA/ROCK信號(hào)通路治療ADS的藥物可供作陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)論仍有局限性，還應(yīng)在未來(lái)增加應(yīng)用RhoA/ROCK信號(hào)通路阻斷劑的對(duì)照組、擴(kuò)大樣本量等，進(jìn)一步探討桂枝茯苓丸治療ADS的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。