張星賀，宋詠麗，高永超，邰先桃，井夫杰

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿康復(fù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355）

腦性癱瘓（cerebral palsy，CP）簡(jiǎn)稱(chēng)腦癱，是一種嚴(yán)重的腦部損傷綜合征，通常表現(xiàn)為發(fā)育遲緩甚至停滯，運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、認(rèn)知、交流及行為障礙，常伴有癲癇及繼發(fā)性肌肉骨骼疾病等，發(fā)病率為2‰～3.5‰[1-3]。CP患兒所造成的財(cái)力、物力及精力消耗數(shù)倍甚至十?dāng)?shù)倍于正常小兒，給社會(huì)及家庭造成沉重的負(fù)擔(dān)[4]。尋找能夠修復(fù)患兒腦損傷，提高患兒生存質(zhì)量，以及降低家庭負(fù)擔(dān)的治療方式，是當(dāng)代婦產(chǎn)、兒科、康復(fù)等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟須解決的問(wèn)題。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃膏膏摩能夠促進(jìn)CP幼鼠生長(zhǎng)發(fā)育，影響大腦血流供給[5]；還可促進(jìn)CP患兒的體格發(fā)育、改善體質(zhì)[6]；但六味地黃膏膏摩能否促進(jìn)CP腦損傷的修復(fù)尚不清楚。該研究在“腎腦相關(guān)”理論指導(dǎo)下，使用六味地黃膏膏摩對(duì)CP幼鼠進(jìn)行干預(yù)，并與單純推拿、單純涂六味地黃膏相比較。觀察六味地黃膏膏摩對(duì)CP幼鼠大腦皮層損傷修復(fù)的效果并探究六味地黃膏膏摩是否能夠調(diào)控BDNF/TrkB信號(hào)通路，以期為六味地黃膏膏摩的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠18只（雌鼠6只、雄鼠12只），體質(zhì)量250～280 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：43004700063963。飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院清潔級(jí)動(dòng)物房獨(dú)立喂養(yǎng)籠具（Individual ventilated caging system,IVC）中，每籠內(nèi)雌鼠1只，雄鼠2只，室溫22～26℃，相對(duì)濕度50%～60%，光照12 h，黑暗12 h。雌鼠雄鼠自由交配，待雌鼠妊娠后與雄鼠分籠，單獨(dú)喂養(yǎng)至分娩。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物試驗(yàn)倫理批號(hào)：2018 YZ0423。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員資格證書(shū)號(hào)（云南?。篖A2017163。

1.2 藥物與試劑 六味地黃膏按照?qǐng)F(tuán)隊(duì)前期已獲授權(quán)的國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)進(jìn)行制作[7]，六味地黃膏用量參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》“動(dòng)物與人體等效劑量折算系數(shù)”[8]，計(jì)算得出CP幼鼠每日用量為33.8 g/kg。兔抗大鼠BDNF一抗（批號(hào)：ab108319）、兔抗大鼠TrkB一抗（批號(hào)：ab18987）、小鼠抗大鼠β-actin一抗（批號(hào)：ab8224）、羊抗兔二抗（批號(hào)：ab205718）、羊抗小鼠二抗（批號(hào)：ab205719）（Abcam公司）；BDNF ELISA試劑盒（批號(hào)：ml302829）、TrkB ELISA試劑盒（批號(hào)：ml035685）（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；尼氏染色試劑盒（Solarbio公司，批號(hào)：G1430）。

1.3 主要儀器ChemiDoc XRS+凝膠成像儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Spectra酶標(biāo)儀（美國(guó)美谷分子儀器有限公司）；Primo Star正置生物顯微鏡（德國(guó)卡爾蔡司公司）。

1.4 造模與分組 于幼鼠出生后第2天稱(chēng)體質(zhì)量，選取50只體質(zhì)量7～11 g的幼鼠作為備選對(duì)象。第3天造模前，采用RAND函數(shù)隨機(jī)選擇10只幼鼠作為假手術(shù)對(duì)照組，其余40只幼鼠采用左側(cè)頸總動(dòng)脈凝斷合并缺氧的方式制備CP模型。采用異氟烷麻醉幼鼠，以幼鼠停止活動(dòng)，四肢癱軟，掐尾無(wú)反應(yīng)為度；用75%酒精棉球?qū)︻i部皮膚進(jìn)行消毒處理后，在解剖顯微鏡下切開(kāi)頸部正中偏左側(cè)皮膚，找到左側(cè)頸總動(dòng)脈；分離附近組織及伴行神經(jīng)，提起血管并使用電凝筆凝斷左側(cè)頸總動(dòng)脈；縫合傷口并消毒；幼鼠復(fù)蘇后，將其置于37℃恒溫的密閉缺氧箱中，氧含量6%，缺氧3 h后取出。假手術(shù)對(duì)照組同樣在麻醉后切開(kāi)頸部正中偏左側(cè)皮膚，找到左側(cè)頸總動(dòng)脈，但不予血管凝斷及缺氧。造模后再次采用RAND函數(shù)將40只CP模型幼鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、推拿組、涂膏組及膏摩組。

1.5 實(shí)驗(yàn)干預(yù) 自第4天開(kāi)始，推拿組采用指摩法對(duì)腎俞穴進(jìn)行操作，60次/min，壓力為0.25～0.35 N，每次2 min，1次/d，共干預(yù)28 d。涂膏組將六味地黃膏涂于腎俞穴部位（不予多余的抹動(dòng)），1次/d，共干預(yù)28 d。膏摩組將六味地黃膏涂于腎俞穴部位，并采用指摩法進(jìn)行推拿操作，60次/min，壓力為0.25～0.35 N，每次2 min，1次/d，共干預(yù)28 d。假手術(shù)對(duì)照組、模型對(duì)照組不予干預(yù)操作，在其余3組接受干預(yù)操作的同時(shí)將其與母鼠分籠進(jìn)行禁食處理。

1.6 觀察指標(biāo) 干預(yù)28 d后將幼鼠麻醉處死，抽取心尖血并取上清液，-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。在每組幼鼠內(nèi)取5只幼鼠大腦組織制成石蠟切片（10μm）；剩余5只幼鼠進(jìn)行取材，取出大腦皮層后立刻進(jìn)行裂解，離心后取上清液，作為皮層的樣品蛋白，-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.1 神經(jīng)元形態(tài)數(shù)量 采用尼氏染色法觀察大腦皮層神經(jīng)元數(shù)量及形態(tài)分布。大腦石蠟切片65℃烘烤5 min，經(jīng)脫蠟水化后，按照尼氏染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，脫水透明后中性樹(shù)膠封片觀察。從每只幼鼠大腦石蠟切片中，隨即取3片進(jìn)行染色，每個(gè)切片在皮層部位隨機(jī)選擇3個(gè)視野，在10倍目鏡及40倍物鏡下拍照。采用Image J進(jìn)行神經(jīng)元計(jì)數(shù)。

1.6.2 血清BDNF/TrkB含量 從-80℃超低溫冰箱中取出血清樣品，并置于-20℃冰箱2 h及4℃冰箱1 h進(jìn)行梯度解凍，然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用Spectra酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式計(jì)算濃度。

1.6.3 大腦皮層BDNF/TrkB蛋白表達(dá)水平 皮層樣品蛋白變性后，規(guī)定蛋白上樣量為50μg，根據(jù)樣品蛋白濃度，計(jì)算樣品蛋白的上樣體積。灌注分離膠、壓縮膠，然后上樣。80V電泳20min，120 V電泳80 min。22 V轉(zhuǎn)模80 min。漂洗后采用5%的脫脂牛奶封閉液在搖床上緩慢搖動(dòng)封閉2 h。加入稀釋好的兔抗大鼠BDNF一抗（1:1 000）；兔抗大鼠TrkB一抗（1:1 000）；小鼠抗大鼠β-actin一抗（1:1 000），放入4℃冰箱內(nèi)的搖床上緩慢搖動(dòng)12 h。漂洗后加入稀釋好的二抗；羊抗兔二抗（1:5 000）；羊抗小鼠二抗（1:5 000），室溫?fù)u床緩慢搖動(dòng)1 h。漂洗后進(jìn)行曝光并拍照。導(dǎo)入Image J對(duì)條帶的平均光密度進(jìn)行測(cè)量，并對(duì)比內(nèi)參蛋白β-actin的比值作為被測(cè)蛋白量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，鑒于尼氏染色類(lèi)型，對(duì)其采用半定量分析。在進(jìn)行比較前，采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)性，P〈0.1為數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布；采用F檢驗(yàn)驗(yàn)證方差齊性，P〈0.1為數(shù)據(jù)方差不齊。采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney檢驗(yàn)）進(jìn)行組間的比較，P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組幼鼠大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量比較 假手術(shù)對(duì)照組幼鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，分布均勻，核漿界限清晰，染色深淺、透明度較一致，尼氏小體較多且呈虎斑樣分布。模型對(duì)照組幼鼠大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)異常，分布不規(guī)則，核漿界限不清晰，形狀大小不一，染色深淺、透明度不一，尼氏小體較少。與模型對(duì)照組比較，推拿組、涂膏組及膏摩組幼鼠大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)及分布均有所改善，染色深淺、透明度較為一致，尼氏小體較多。與假手術(shù)對(duì)照組比較，推拿組、涂膏組及膏摩組幼鼠大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)異常，分布不規(guī)則，核漿界限不清晰，形狀大小不一，染色深淺、透明度不一，尼氏小體較少。（見(jiàn)圖1）

圖1 大腦皮層神經(jīng)元尼氏染色結(jié)果（×400）

模型對(duì)照組幼鼠大腦皮層正常形態(tài)神經(jīng)元數(shù)量少于假手術(shù)對(duì)照組（P〈0.01）；推拿組、涂膏組、膏摩組幼鼠大腦皮層正常形態(tài)神經(jīng)元數(shù)量均多于模型對(duì)照組（P〈0.01），且均少于假手術(shù)對(duì)照組（P〈0.01）。膏摩組幼鼠大腦皮層正常形態(tài)神經(jīng)元數(shù)量多于推拿組、涂膏組（P〈0.05或P〈0.01）；推拿組幼鼠大腦皮層正常形態(tài)神經(jīng)元數(shù)量與涂膏組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見(jiàn)表1）

表1 各組幼鼠大腦皮層正常形態(tài)神經(jīng)元數(shù)量比較（±s，個(gè)）

表1 各組幼鼠大腦皮層正常形態(tài)神經(jīng)元數(shù)量比較（±s，個(gè)）

注：與假手術(shù)對(duì)照組比較，aP〈0.01；與模型對(duì)照組比較，bP〈0.01；與膏摩組比較，cP〈0.05，dP〈0.01

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 正常形態(tài)神經(jīng)元數(shù)量假手術(shù)對(duì)照組 5 103.65±11.73模型對(duì)照組 5 71.31±10.49a推拿組 5 84.94±9.08a b c涂膏組 5 81.34±8.63a b d膏摩組 5 89.32±10.33a b

2.2 各組幼鼠血清BDNF、TrkB含量比較 模型對(duì)照組幼鼠血清BDNF、TrkB含量高于假手術(shù)對(duì)照組（P〈0.05）；膏摩組幼鼠血清BDNF含量高于模型對(duì)照組（P〈0.05）；膏摩組幼鼠血清TrkB含量低于推拿組，（P〈0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 各組幼鼠血清BDNF、TrkB含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組幼鼠血清BDNF、TrkB含量比較（±s，pg/mL）

組別 動(dòng)物數(shù)（只） BDNF TrkB假手術(shù)對(duì)照組 10 448.92±75.45 1 154.97±150.22模型對(duì)照組 10 518.61±100.04a 1 352.77±182.99a推拿組 10 549.50±124.47 1 463.92±224.00c涂膏組 10 532.87±93.14 1 354.63±249.67膏摩組 10 572.21±79.55b 1 292.89±147.59

2.3 各組幼鼠大腦皮層BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平比較 模型對(duì)照組幼鼠大腦皮層BDNF蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)對(duì)照組（P〈0.05），TrkB蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；膏摩組幼鼠大腦皮層BDNF蛋白表達(dá)水平高于模型對(duì)照組（P〈0.01），但TrkB低于模型對(duì)照組（P〈0.05）；膏摩組幼鼠大腦皮層BDNF蛋白表達(dá)水平高于推拿組及涂膏組（P〈0.01），但TrkB蛋白表達(dá)水平低于推拿組及涂膏組（P〈0.05）。（見(jiàn)圖2、表3）

圖2 各組幼鼠大腦皮層BDNF、TrkB蛋白表達(dá)電泳條帶

表3 各組幼鼠大腦皮層BDNF、TrkB表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組幼鼠大腦皮層BDNF、TrkB表達(dá)水平比較（±s）

注：與假手術(shù)對(duì)照組比較，aP〈0.05；與模型對(duì)照組比較，bP〈0.01，cP〈0.05；與膏摩組比較，dP〈0.01，eP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） BDNF TrkB假手術(shù)對(duì)照組 5 0.54±0.11 0.89±0.11模型對(duì)照組 5 0.72±0.14a 1.09±0.26推拿組 5 0.77±0.11d 1.21±0.23e涂膏組 5 0.82±0.07d 1.16±0.37e膏摩組 5 1.04±0.12b 0.85±0.20c

3 討 論

腦癱屬中醫(yī)學(xué)“痿證”“癡呆”“五遲”“五軟”“五硬”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，父母素體虛弱、精血不足，妊娠期外邪侵襲、擾動(dòng)胎氣，亦或產(chǎn)時(shí)風(fēng)邪入侵等小兒出生前后各種因素是小兒腦癱的主要病因。小兒先天稟賦不足則腎精化髓無(wú)力、腦髓失養(yǎng)、腦絡(luò)損傷，故出現(xiàn)四肢萎軟無(wú)力、行遲、立遲、語(yǔ)遲、智力低下、反應(yīng)遲鈍、四肢僵硬、癡呆等癥狀。如元代醫(yī)家曾世榮《活幼心書(shū)·五軟》曰：“五軟證，名曰膽怯，良由父精不足，母血素衰而得?！鼻宕t(yī)家吳謙《醫(yī)宗金鑒·五遲》曰：“小兒五遲之癥，多因父母氣血虛弱，先天有虧，致兒生下筋骨軟弱，行步艱難，齒不速長(zhǎng)，坐不能穩(wěn)，要皆腎氣不足之故?！鼻宕t(yī)家張溫《張氏醫(yī)通·嬰兒門(mén)》曰：“五遲者……良由父母精血不足，腎氣虛弱,不能榮養(yǎng)而然。”蔡陸仙《中國(guó)醫(yī)藥匯?！ふ撃X以腎為本》曰：“人之靈固莫于腦矣，然其靈根實(shí)起于腎……而腦髓實(shí)由腎主之，精足則髓足，髓足則腦充?！爆F(xiàn)代著名醫(yī)家李德修《李德修小兒推拿技法·腦炎》曰：“腎通腦最快，治腦炎需多推”。王國(guó)才亦認(rèn)為CP無(wú)論病因如何，都勢(shì)必造成腎精虧虛、髓海失養(yǎng)，其治療均需補(bǔ)腎[9]。因此，CP的治療當(dāng)重在補(bǔ)腎益腦、填精益髓，以起到濡養(yǎng)修復(fù)大腦的作用[10-12]。

BDNF是第2個(gè)被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（neurotrophins，NTs）家族成員，在海馬和大腦皮質(zhì)組織中含量最高，其同時(shí)也是腦內(nèi)含量最高的NTs。NTs具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、分化、修復(fù)、再生，重塑神經(jīng)元突觸等作用。NTs在神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制，神經(jīng)細(xì)胞存活的增強(qiáng)，以及發(fā)揮相關(guān)功能等方面具有重要作用。NTs家族目前已發(fā)現(xiàn)眾多類(lèi)型，其中包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）、BDNF、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3（neurotrophin 3，NT3）及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4/5（neurotrophin 4/5，NT-4/5）等[13]。NTs發(fā)揮功能需要通過(guò)與其相對(duì)應(yīng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體相結(jié)合，高親和力受體為酪氨酸蛋白激酶（tyrosine kinase receptor，Trk），其通常發(fā)揮維持神經(jīng)細(xì)胞存活生長(zhǎng)的正向效應(yīng)。低親和力受體為p75，與NTs結(jié)合可發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的負(fù)向效應(yīng)，但p75在一定量的時(shí)候反而可以促進(jìn)NTs與Trk的結(jié)合。NTs與Trk或p75相結(jié)合后，引起受體同源二聚化，受體分子的自身酪氨酸磷酸化，磷酸化的酪氨酸召集細(xì)胞內(nèi)的多種相關(guān)靶信號(hào)分子以最終啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（見(jiàn)圖3），以發(fā)揮相關(guān)的調(diào)控作用[13-15]。

圖3 NTs家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

由多胚層原始神經(jīng)干細(xì)胞分化而來(lái)的胚胎干細(xì)胞，具有自我更新、增殖、分化的能力，可分化為多種重要的神經(jīng)元[16]。胚胎干細(xì)胞與中醫(yī)先天之精具有相同的來(lái)源，兩者均來(lái)源于父母之精。如《靈樞·決氣篇》曰：“兩神相搏，合而成形，常先身生，是謂精?！奔茨I中的先天之精稟受于父母，為人體胚胎形成的基本構(gòu)成物質(zhì)。同時(shí)，胚胎干細(xì)胞能夠在子宮內(nèi)分化為機(jī)體發(fā)育的組織細(xì)胞并促進(jìn)人體胚胎的形成，而中醫(yī)“腎精”具有調(diào)控生殖、充骨生髓、補(bǔ)養(yǎng)腦髓、激發(fā)臟腑功能及維持正常的生命運(yùn)行等作用。故先天之精與胚胎干細(xì)胞具有相同的屬性特點(diǎn)，胚胎干細(xì)胞是先天之精的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)細(xì)胞層次的存在形式[17]。而中醫(yī)“髓”具有充潤(rùn)濡養(yǎng)大腦、維持大腦正常功能運(yùn)轉(zhuǎn)的作用，大腦的濡養(yǎng)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中可表現(xiàn)為神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化、成熟，神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，神經(jīng)元的存活，損傷神經(jīng)元的修復(fù)，以及神經(jīng)元非程序性凋亡的抑制等[18]。有研究表明，補(bǔ)腎類(lèi)中藥能夠改善神經(jīng)系統(tǒng)疾病動(dòng)物模型的癥狀，促進(jìn)BDNF、TrkB等相關(guān)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)[19-20]。因此，中醫(yī)“腎腦相關(guān)”理論中大腦的濡養(yǎng)則可能與大腦神經(jīng)元狀態(tài)、神經(jīng)元數(shù)量及NTs的變化有關(guān)[16-18]。

六味地黃丸首見(jiàn)于宋代醫(yī)家錢(qián)乙《小兒藥證直·地黃丸》：“地黃丸，治腎怯失音，囟開(kāi)不合，神不足，目中白睛多，面色白等方?！笨梢?jiàn)古代醫(yī)家最初的用意是將此方用來(lái)治療小兒囟門(mén)遲閉、齒遲、語(yǔ)遲、立遲、行遲及發(fā)遲等“五遲”“五軟”及“痿證”，與當(dāng)代CP先天受損、臟腑精氣不足、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩或停止等病因癥狀相吻合。本研究將具有滋陰補(bǔ)腎、填精益髓作用的“六味地黃丸”制作為外用膏劑[7]，并與同樣具有補(bǔ)腎益腦功用的腎俞穴相結(jié)合，通過(guò)六味地黃膏膏摩的干預(yù)方式對(duì)CP幼鼠進(jìn)行干預(yù)。采用與中醫(yī)“髓”功能相似的皮層神經(jīng)元形態(tài)數(shù)量及BDNF/TrkB作為主要指標(biāo)進(jìn)行觀察。大腦皮層神經(jīng)元尼氏染色表明，以補(bǔ)腎益腦為核心治則，不論采用摩腎俞的推拿刺激、六味地黃膏外用或者兩者結(jié)合的六味地黃膏膏摩，均能對(duì)CP幼鼠起到濡養(yǎng)大腦、修復(fù)大腦皮層受損神經(jīng)的作用，但3種干預(yù)方式的修復(fù)作用有限；而推拿與六味地黃膏相結(jié)合的六味地黃膏膏摩法能夠更有效地修復(fù)皮層神經(jīng)損傷。BDNF/TrkB是腦損傷后多種修復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一種重要啟動(dòng)因子。BDNF/TrkB總量及磷酸化表達(dá)的增加能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的存活，并對(duì)神經(jīng)損傷起到積極的修復(fù)作用。模型對(duì)照組CP幼鼠在缺血缺氧腦損傷后BDNF/TrkB的表達(dá)明顯增加，以發(fā)揮腦損傷后的自我修復(fù)的作用。與此同時(shí)，六味地黃膏膏摩能夠更加顯著地誘導(dǎo)CP幼鼠血清與大腦皮層BDNF的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)CP幼鼠腦損傷修復(fù)的效果，而同樣以補(bǔ)腎為核心的推拿腎俞或涂六味地黃膏膏對(duì)CP幼鼠BDNF/TrkB表達(dá)的影響均不顯著，但膏摩組CP幼鼠大腦皮層TrkB蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。

六味地黃膏膏摩相較單純推拿或者單純涂膏，對(duì)大腦皮層神經(jīng)元的損傷具有更好的修復(fù)作用，且擁有更強(qiáng)的促BDNF表達(dá)作用，但膏摩組TrkB表達(dá)水平較模型對(duì)照組有所減少。究其原因，膏摩組除了摩腎俞的經(jīng)穴效應(yīng)外，還可能起到刺激局部皮膚改善血液循環(huán)促進(jìn)六味地黃膏透皮吸收的作用；而TrkB磷酸化是后續(xù)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一種形式，在TrkB總量減少的同時(shí)，其磷酸化程度很有可能已經(jīng)增強(qiáng)，能夠更有效地觸發(fā)后續(xù)的細(xì)胞存活相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而對(duì)神經(jīng)元損傷起到促進(jìn)修復(fù)的作用；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)神經(jīng)損傷修復(fù)是多通路、多樣化、復(fù)雜化的，中醫(yī)“髓”濡養(yǎng)大腦的功能除了與BDNF/TrkB相似外，還與NGF、NT3、NT-4/5等具有功能上的相似性。

六味地黃膏膏摩是選擇性脊柱推拿[21]及補(bǔ)腎名方“六味地黃丸”的有機(jī)結(jié)合，能夠避免藥物口服的難題，具有藥物及推拿雙重功效的優(yōu)勢(shì)。六味地黃膏膏摩能夠調(diào)控CP幼鼠生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH）、促生長(zhǎng)激素釋放肽（Ghrelin）及生長(zhǎng)抑制素（SS）等，起到促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的效果，同時(shí)還可影響大腦血流供給[5,22-23]。在經(jīng)過(guò)藥物安全性驗(yàn)證后，我們將六味地黃膏膏摩應(yīng)用于臨床，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)早產(chǎn)低體重兒及CP患兒生長(zhǎng)發(fā)育的作用[6,24-25]。本研究證明了六味地黃膏膏摩能夠?qū)P幼鼠大腦皮層損傷起到修復(fù)作用，且優(yōu)于單純推拿或六味地黃膏外用；其補(bǔ)腎益腦、修復(fù)腦損傷的機(jī)制可能與BDNF/TrkB信號(hào)通路有關(guān)，但仍可能存在其他的作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步廣泛而深入的研究。