王波金雯周健坤曹立宇

（1.銅陵職業(yè)技術學院醫(yī)學護理系，安徽 銅陵 244061；2.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科，安徽 合肥 230021）

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）屬全球高發(fā)性惡性腫瘤，病死率位居惡性腫瘤第二位［1］，其早期復發(fā)、轉移是影響患者預后生存的關鍵.研究指出，HCC患者中能夠在早期接受有效治療的僅占30%～40%，而針對HCC 早期診斷的臨床腫瘤標記物欠缺敏感性和多樣性［2］.HCC 早期診斷及治療的研究一直以來是科學家們的焦點，因此尋找具有靈敏且特異性強的肝癌目標基因，實現(xiàn)早期診療、提高預后顯得尤為迫切和重要.近年來，長鏈非偏碼RNA（Long non-coding RNA，Lnc RNA）已成為惡性腫瘤生物學行為研究領域的熱點基因.諸多研究顯示［3-5］，Lnc RNA可參與調節(jié)惡性腫瘤細胞周期、介導信號調控、影響腫瘤耐藥和微血管生成等，而不同的Lnc RNA在各種臟器或組織中呈特異性表達.本研究旨在觀察并探討Lnc RNA家族新成員CTC-459F4.3表達下調對HCC干性增殖及凋亡的影響，以期為HCC的有效診治提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料來源

HepG2細胞培養(yǎng)于ATCC細胞庫.

1.2 主要試劑與儀器

CTC-459F4.3 shRNA 慢病毒質粒（上海吉凱）；DMEM、RPMI 1640、PBS，pH7.4（Gibco，公司）；胎牛血清（Bio IND，04-002-1A）；Antibiotic-Antimycotic、Trypsin-EDTA（0.05%）、牛血清白蛋白（Lifetechnologies）；PI-Annexin V 試劑盒（日本同仁化學，AD10）；酶標儀（BioTek，EPOCH）；流式細胞儀（ACEN，NovoCyte）等.

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與轉染

HepG2細胞系置于10%胎牛血清，5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中，相對濕度90%.0.125%胰蛋白酶作用后，培養(yǎng)基輕洗1次.加入DMEM/RPMI 1640培養(yǎng)基5mL，反復吹打，制成細胞懸液，1：2分瓶置于25mL培養(yǎng)瓶中.于對數(shù)期接種于6孔板中，每孔滴入一定滴度的慢病毒轉染48h，收集并觀察細胞轉染效率.

1.3.2 RT-PCR檢測CTC-459F4.3mRNA表達

分別設CTC-459F4.3 敲低組、對照組、空質粒組.600μl BufferRL 滴入細胞懸液，反復吹打，裂解、離心后，收集mRNA溶液.分光光度計定量提取10ug估算總量，超低溫保存.按照cDNA反轉錄說明書配置反應體系，行擴增實驗.50℃，2min；95℃，10min；40循環(huán)，實驗重復3次.采用2-ΔΔCt法計算CTC-459F4.3 mRNA 相對表達量.引物序列由華大基因合成，Primer3 軟件設計如下：CTC459F4.3-F：TGCCCCTGGTCCCCTTGTCG；CTC459F4.3-R：TCTGCTGGCCTTGTCTGGCG.

1.3.3 肝癌瘤球成形實驗

將生長狀態(tài)良好的細胞消化后離心，去除含血清培養(yǎng)基，PBS清洗兩次；用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，并計數(shù).選擇超低吸附細胞培養(yǎng)板，每孔500-5000個細胞，補加培養(yǎng)基，10d左右完成培養(yǎng)，實驗重復3次.觀察細胞成球計數(shù)并拍照.

1.3.4 流式技術檢測細胞凋亡率

各組細胞分別1000rpm離心5min；用1×Annexin V Binding Solution 調整細胞密度到1×106/mL的懸液；取100ul 細胞懸液，加入5ul 的AnnexinV-FITC 結合物，再加入5ul PI solution；室溫避光15min；加入400ul 1×Annexin V Binding Solution，1h內上機行細胞凋亡測定.

1.3.5 Western-Blot檢測

提取目標基因總蛋白，SDS－PAGE 電泳1.5h，4%濃縮膠電流為25mA，12%分離膠電流為30mA.400mA轉膜轉移0.5h、1%BSA封閉40min；一抗4℃孵育過夜；二抗孵育37℃1h；PBS清洗3次.ECL顯色、熒光拍照，凝膠圖像系統(tǒng)分析灰度值.

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 CTC-459F4.3 shRNA轉染效率判定

CTC-459F4.3 敲低組、對照組、空質粒組CTC-459F 4.3mRNA 表達量分別為：0.376±0.032、0.746±0.0492、0.716±0.011；組間比較發(fā)現(xiàn)，敲低組CTC-459F4.3mRNA表達量與對照組和空質粒組比較均有顯著差異（F=105.408，P<0.001）；對照組CTC-459F4.3mRNA 表達量與空質粒組比較無差異（P=0.330）.

2.2 Western-Blot檢測結果

Western-Blot 灰度分析顯示，CTC-459F4.3 敲低組、對照組、空質粒組SOX2 相對表達量分別為6.041±0.070、1.234±0.081、1.221±0.096，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=3370.154，P<0.001）；敲低組與對照組、空質粒組相比有差異（P<0.001），對照組與空質粒組相比無差異（P=0.850）.4-OCT 相對表達量分別為5.849±0.575、1.321±0.027、1.463±0.059 組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=178.251，P<0.001），敲低組與對照組、空質粒組相比有差異（P<0.001），對照組與空質粒組相比無差異（P=0.620），見圖1.

圖1 注：a：各組SOX2和4-OCT Western-Blot灰度圖；b：各組SOX2和4-OCT相對表達量

2.3 肝癌瘤球成形實驗結果

CTC-459F4.3 敲低組、對照組、空質粒組瘤球成球數(shù)依次為32.583±3.502、8.417±0.996、9.333±1.775.敲低組瘤球成球數(shù)顯著高于對照組、空質粒組，差異有統(tǒng)計學意義（F=411.515，P<0.001）；對照組與空質粒組細胞瘤球成球數(shù)相比無明顯差異（P=0.301）.見圖2

圖2 a：CTC-459F4.3基因敲除組；b：對照組；c：空質粒組；d：各組細胞成球數(shù)結果

2.4 流式技術檢測細胞凋亡結果

CTC-459F4.3 敲低組、對照組、空質粒組細胞凋亡率依次為（4.063±0.017）%、（7.980±0.064）%、（8.013±0.030）%.敲低組細胞凋亡率顯著低于對照組、空質粒組，差異有統(tǒng)計學意義（F=88.704，P<0.001）；對照組與空質粒組細胞凋亡率相比無明顯差異（P=0.925）.見圖3

圖3 a：CTC-459F4.3基因敲除組；b：對照組；c：空質粒組；d：各組細胞凋亡率結果

3 討論

肝癌干細胞（Liver Cancer Stem Cell，LCSCs）作為母源性腫瘤細胞存在于HCC 之中，具有強大的自我更新和分化功能，在肝癌進展中發(fā)揮重要作用.Lnc RNAs 的異常表達在LCSCs 生物學活動中充當重要角色，劉晨等［6］認為LCSCs是肝癌的起源，LncRNA NEAT1高表達可能通過活化Hippo信號通路進而實現(xiàn)了LCSCs 擴增與自我更新的促進. LncRNA KCNQ1OT1 可通過競爭性結合mi?croR-NA-504 促進HCC 的增殖［7］.LncRNA CTC-459F4.3 為新近發(fā)現(xiàn)的基因，有關其與肝癌發(fā)生、發(fā)展關系的報道并不多見，有研究顯示，LncRNA RNA CTC-459F4.3過表達可通過上調CTDSPL抑制肝癌細胞的增殖和遷移，但具體機制并未闡明［8］.LncRNA RNA CTC-459F4.3更多地被應用于基因共表達網絡分析中的協(xié)同作用，一項肺腺癌的基因譜網絡分析研究發(fā)現(xiàn)其為核心因子之一，可參與調控多種其它基因［9］.

SOX2和OCT4是多能性干細胞調控因子，它們在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進細胞自我更新以及增殖等功能，是腫瘤干細胞特性的重要分子標記物.SOX2可通過調控Wnt/β-catenin通路影響胃癌的進展［10］.Oct4高表達可增強惡性腫瘤細胞的自我更新和分化能力與CRC患者的肝轉移密切相關［11］.血管生成是惡性腫瘤的主要生物學特性之一，與癌細胞干性增殖關系密切［12］，也是惡性腫瘤靶向治療的重要路徑之一.Oct4在LCSCs血管生成中起到至關重要的作用，具體機制可能為通過介導AKT-NF-kB-p65信號軸實現(xiàn)的［13］.在SOX2與OCT4結合的復合物結構中，OCT4/Lys-151和SOX2/Asp-107可形成明顯的鹽橋結構，其在蛋白修飾以及殘基突變中可以影響腫瘤細胞干性特征的穩(wěn)定性［14］.可見，SOX2和OCT4在腫瘤進展過程中扮演了重要角色，為此，本研究采用West?ern-Blot技術檢測2個基因的表達水平，以進一步探討LncRNA RNA CTC-459F4.3調低后對HCC干性能力的影響.

實驗結果顯示，CTC-459F4.3shRNA 慢病毒質?？沙晒D染并構建CTC-459F4.3 低表達的HepG2 肝癌細胞系；CTC-459F4.3 調低后，SOX2 和OCT4 相對表達量顯著上調（P<0.001），提示CTC-459F4.3可能以直接或間接的方式參與了SOX2和OCT4表達水平的調控從而實現(xiàn)對HCC細胞的干性能力的影響.為進一步明確CTC-459F4.3調低后對HCC的生物學活動作用，肝癌瘤球成形實驗結果顯示，CTC-459F4.3 調低組的肝癌細胞的聚集和增殖能力顯著增強；流式技術檢測顯示，CTC-459F4.3 調低組的肝癌細胞凋亡率下降. 基于上述推測，調低CTC-459F4.3 可通過SOX2 和OCT4增強HCC細胞的干性能力獲得，并可促進肝癌細胞的干性增殖和細胞凋亡抑制，在肝癌進展中可能起到了負性調控作用，這與張軍等［8］的研究結果一致.癌細胞的干性能力與腫瘤的惡性程度成正相關性，LCSCs可能是HCC耐藥、高復發(fā)和轉移的源頭［15-16］.CSCs可能促成了腫瘤細胞向成熟腫瘤細胞分化過程中的耐藥突變以及耐藥維持［17］.上述提示，針對LCSCs進一步研究CTC-459F4.3的作用，可能為HCC的早期診斷、復發(fā)轉移防治及抗腫瘤耐藥等方面提供新的思路.

綜上，CTC-459F4.3表達調低可以促進肝癌細胞干性增殖、抑制其凋亡，有望成為肝癌診治的新靶點.而該基因與肝癌進展關系的詳細機制目前尚不明確，仍需進一步研究.