柴倩囡 韓彥弟 張富霞 王文麗 邵莉桃 王璐杰漢佳昕 胡 嬌 牛 鑫，*

（1.河西學院甘肅省應用真菌工程實驗室/甘肅省食用菌遺傳育種重點實驗室/祁連山食用菌產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；2.河西學院農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學院；3.河西學院生命科學與工程學院，甘肅 張掖 734000）

我國農(nóng)作物秸稈的產(chǎn)量巨大，每年有8億t左右，約占全球總量的20%［1］.秸稈主要由纖維素、半纖維素、木質素及少量細胞壁蛋白組成，其中纖維素約占秸稈干重的40%到50%［1，2］.目前，我國秸稈的利用率不高，絕大部分丟棄于農(nóng)田或就地焚燒，不僅污染環(huán)境還浪費自然資源［3，4］.纖維素是一種由D型葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵形成的直鏈均聚物，聚合度在3000以上，是自然界中最豐富的可再生資源［5］.因此，如何將纖維素轉化為燃料、生物塑料和酶等高附加值產(chǎn)品成為當前研究的熱點，而真菌是生產(chǎn)纖維素酶的首選［6］.灰蓋擬鬼傘是一種食用真菌［7］，屬于中高溫菌，喜濕熱環(huán)境，簡單易培養(yǎng)，僅兩周即可完成整個生活史，其天然培養(yǎng)基為馬糞［8］，能夠僅利用稻草秸稈為培養(yǎng)基生長并產(chǎn)生子實體，但因其子實體較小，且易自溶，因此，其栽培和食用價值有限.灰蓋擬鬼傘屬于白腐真菌能降解纖維素和木質素，可用于秸稈或園林綠化廢棄物等的固體發(fā)酵［9］.

纖維素酶是多種水解酶的統(tǒng)稱，根據(jù)作用方式和對底物的特異性，可分為內(nèi)切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.74和EC 3.2.1.91）和β-葡糖苷酶（EC 3.2.1.21）［10］.內(nèi)切葡聚糖酶通過隨機作用于纖維素鏈生成纖維寡糖，外切葡聚糖酶裂解纖維素鏈末端生成纖維二糖［11］.纖維二糖通過纖維二糖酶（亦稱β-葡糖苷酶）水解生成葡萄糖［12］.三種酶通過協(xié)同機制高效地分解纖維素類生物質.內(nèi)切葡聚糖酶存在于許多糖基水解酶家族，通常真菌內(nèi)切葡聚糖酶含有CBM1s 模塊，主要分布在GH5、7、9、12和45等家族中［13］.GH9家族成員大部分具有纖維素酶活性，GH9糖苷水解酶家族以前被稱為“纖維素酶家族E”［14］.一些來自梭狀芽胞桿菌屬（Clostridia）［15］和擬桿菌屬（Bacteroides）［16，17］的GH9成員被證明具有內(nèi)切木葡聚糖酶（EC 3.2.1.151）或混合鍵連的內(nèi)切葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）活性.另外，在該家族中成員中也發(fā)現(xiàn)具有外切-β-氨基葡萄糖酶（EC 3.2.1.165）［15，18］.GH9家族的所有持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶都包含一個3c CBM結構，并嚴格地附著在GH9催化結構域的c端.該結構域是活性位點的一部分，并且對持續(xù)水解至關重要［19］.CBM3c結構域與纖維素的結合很弱，因為它們?nèi)狈σ恍┍Ｊ氐姆枷阕鍤埢?，而這些殘基在3a和3b家族成員中對纖維素結合很重要［20］.所有已知的植物纖維素酶都屬于GH9，其他大多數(shù)GH9成員分布在真細菌中，但也有兩個古細菌成員和一些真菌、蚯蚓、節(jié)肢動物、脊索動物、棘皮動物和軟體動物成員中鑒定到GH9家族水解酶.GH9中有兩個亞群E1和E2，E1只包含來自細菌的纖維素酶，包括來自好氧菌和厭氧菌的纖維素酶，E2包含一些細菌和所有非細菌纖維素酶［21］.進化研究表明，真核生物GH9成員包含兩個古老的單系群：一個包括所有動物成員，另一個包括所有植物成員［22］.所有已知的持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶基因都屬于E1亞組.迄今為止，已研究的大多數(shù)植物GH9家族水解酶都是內(nèi)切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4），對結晶纖維素幾乎沒有活性，但對可溶性纖維素衍生物有明顯的活性，如羧甲基纖維素（CMC）［23］.由于GH9酶的廣泛分布和數(shù)量眾多，植物GH9酶可進一步細分為三大類［24］，A類蛋白質是膜錨定的，B類蛋白質是分泌性的，C類蛋白質也是分泌性的，但含有家族49碳水化合物結合模塊（CBM49）［25］.而對于真菌GH9 家族成員的研究較少.本研究采用生物信息學分析方法，對灰蓋擬鬼傘的GH9 蛋白（Cc_GH9）的基本理化性質、亞細胞定位、信號肽、跨膜結構、二級結構、三級結構、磷酸化位點、糖基化位點、功能結構域、系統(tǒng)發(fā)育和基序進行了分析，為后續(xù)Cc_GH9在灰蓋擬鬼傘纖維素酶參與子實體生長發(fā)育過程機制的研究奠定基礎，也為真菌GH9家族纖維素酶的開發(fā)提供新思路.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

試驗中Cc_GH9 序列來源于美國國家生物技術中心（national center for biotechnology information，簡稱NCBI）數(shù)據(jù)庫，蛋白名稱為9 glycosyl hydrolase，序列登錄號為XP_001837301.1（=EAU84918.1）.

1.2 研究方法

在NCBI中以“9 glycosyl hydrolase”和“Coprinopsis cinerea”進行檢索，選擇結果中的“Gene”選項，點擊第一個結果“CC1G_00437”，即可獲得Cc_GH9 的基因信息；使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預測Cc_GH9的分子量、等電點、氨基酸含量、不穩(wěn)定指數(shù)和脂肪族系數(shù)等等理化參數(shù)；采用SignalP-5.0服務器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析Cc_GH9的信號肽及其剪切位點；利用WoLFPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）和CELLO v2.5（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）對Cc_GH9 進行亞細胞定位分析；采用DictyOGlye1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/）預測Cc_GH9 的糖基化位點；采用Sompa（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測Cc_GH9的二級結構；采用TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）分析Cc_GH9 的跨膜結構；使用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進行同源建模；使用NCBI 中的保守域數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）分析Cc_GH9的功能結構域，打開以上網(wǎng)址，粘貼Cc_GH9 氨基酸序列至蛋白或核酸查詢序列（Protein or Nucleotide Query Sequence）文本框點擊提交查詢按鈕即可進入結果頁面；采用MEGA-X中的鄰接（Neighbor-joining，NJ）構建Cc_GH9的系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇自舉法（bootstrap method）檢驗系統(tǒng)發(fā)生，自舉重復次數(shù)設置為1000次；利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）對Cc_GH9進行基序分析.

2 結果與分析

2.1 Cc_GH9編碼基因的分析

Cc_GH9的基因位于灰蓋鬼傘基因組序列（NW_003307540.1）中的5號染色體上，基因標簽為CC1G_00437，全長為2298nt（1899563～1901860），含有11 個外顯子，分別為1～289，348～368，419～444，495～543，599～669，726～768，819～1421，1471～1595，1651～1702，1758～1951，2002～2298，編碼基因長1770 nt（圖1），登錄號為XM_001837249，編碼蛋白9 glycosyl hydrolase，登錄號為XP_001837301.該基因5’端為氧化還原酶基因（CC1G_00438），3’端為同化亞硫酸鹽還原酶基因（CC1G_00436）.

圖1 灰蓋擬鬼傘GH9家族水解酶基因結構Fig1 Structure of the GH9 family hydrolase（Cc_GH9）gene of Coprinopsis cinerea

2.2 Cc_GH9的理化性質分析

使用ProtParam分析Cc_GH9的理化性質，結果表明，Cc_GH9由589個氨基酸組成，其中含量較高的氨基酸組成有丙氨酸（63個，10.7%）、亮氨酸（59個，10.0%）和絲氨酸（47個，8.0%）.Cc_GH9的分子量為64997.79u，理論等電點為4.93，序列中含有5個半胱氨酸，可能形成二硫鍵.Cc_GH9蛋白序列中帶負電荷的氨基酸殘基數(shù)為66個，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)為50個，分子式為C2922H4423N761O892S16.假設Cc_GH9的胱氨酸殘基以半胱氨酸的形式出現(xiàn)，即形成二硫鍵，其消光系數(shù)為136390L/（mol·cm），吸光度（D280nm）為2.098；如果序列中的二硫鍵全部打開，則Cc_GH9的消光系數(shù)為136140L/（mol·cm），吸光度（D280nm）為2.095.當Cc_GH9的N端為甲硫氨酸時，在哺乳動物的網(wǎng)織紅細胞體外培養(yǎng)的半衰期為30h，在酵母細胞內(nèi)的半衰期大于20h，在大腸桿菌細胞內(nèi)的半衰期大于10h.Cc_GH9的不穩(wěn)定指數(shù)為36.32，小于40，故為穩(wěn)定蛋白.Cc_GH9的脂肪指數(shù)為77.11，其親水性平均值為-0.322，故Cc_GH9為親水性蛋白.

2.3 Cc_GH9的信號肽和亞細胞定位分析

使用SignalP-5.0分析了Cc_GH9蛋白序列的信號肽和剪切位點，N端前21個氨基酸為信號肽序列，剪切位點為ALA-QL（圖2），故而Cc_GH9 可能為分泌性蛋白. 使用WoLFPSORT 和CELLO v.2.5 對Cc_GH9的亞細胞定位進行了預測分析，結果表明最有可能定位在胞外.

圖2 Cc_GH9信號肽分析結果Fig 2 signal peptide analysis results of Cc_GH9

2.4 Cc_GH9的跨膜螺旋結構分析

使用TMHMM-2.0分析了Cc_GH9的跨膜螺旋結構（圖3），結果表明含有1個跨膜螺旋，1～555位氨基酸位于膜外部，556～578位氨基酸為跨膜螺旋部分，579～589位氨基酸位于膜內(nèi)部.因此，Cc_GH9可能為跨膜蛋白.

圖3 Cc_GH9的跨膜螺旋結構預測Fig 3 Prediction of transmembrane helices in CC_GH9

2.5 Cc_GH9的二級結構分析

利用SOPMA 分析了Cc_GH9 的二級結構（圖4），結果表明其二級結構由α-螺旋（222 個，占37.69%）、延伸鏈（75 個，占12.73%）、β-轉角（16 個，占2.72%）和無規(guī)則卷曲（276 個，占46.86%）組成.因此，無規(guī)則卷曲和α-螺旋是Cc_GH9二級結構中最主要的結構元件.

圖4 Cc_GH9的二級結構預測Fig 4 The secondary structure Prediction of Cc_GH9

2.6 Cc_GH9的三級結構分析

使用SWISS-MODEL分析了Cc_GH9的三級結構，得到了3個預測模型，其中以1tf4.1.A為模板的預測模型其全局模型質量評估分數(shù)（GMQE）為0.52，高于其他模板預測模型，更加接近1；而QMEAN得分為-3.10，較其他預測模型更接近于0，表明該模型與實驗結果具有較好的一致性.若QMEAN得分小于-4.0，則表明模型質量與目的蛋白匹配度差.該模型與模板的相似度為39.26%.從Cc_GH9的預測三級結構（圖5A）可以看出，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是主要組成結構（圖5A），它們可能對于Cc_GH9結構的穩(wěn)定和酶的功能具有重要意義.

圖5 Cc_GH9的三級結構預測（A）卡通格式（B）表面格式Fig.5 Prediction of tertiary structure of CC_GH9（A）cartoon format（B）surface format

2.7 Cc_GH9的翻譯后修飾預測

使用NetPhos預測了Cc_GH9氨基酸序列中的磷酸化修飾位點，從圖6可以看出Cc_GH9的氨基酸序列中在29 個絲氨酸（S）上、17 個蘇氨酸（T）上和17 個酪氨酸（Y）上可能發(fā)生磷酸化修飾.使用DictyO?Glyc-1.1 預測了Cc_GH9 氨基酸序列中O-α-N-乙酰葡萄糖胺修飾糖基化位點（圖7），在182 位絲氨酸（S）處可能發(fā)生O-糖基化修飾.

圖6 Cc_GH9的磷酸化位點分析Fig 6 The predited phosphorylation site in Cc_GH9

圖7 Cc_GH9的O-糖基化位點分析Fig 7 The preditedO-glycosylation site in Cc_GH9

2.8 Cc_GH9的功能結構域分析

使用NCBI中的保守域數(shù)據(jù)庫對Cc_GH9的功能結構域進行了分析（圖8），可以看出Cc_GH9屬于糖基水解酶9 超家族（Glyco_hydro_9 superfamily），Cc_GH9 序列中55～500 位氨基氨酸序列含有Glyco_hy?dro_9 保守結構域，表明該蛋白能夠水解纖維素鏈中的β-1，4-糖苷鍵.但是在325-384 位氨基酸之間存在缺口（gap），表明該蛋白可能在功能方面較其他物種中的GH9蛋白存在差異.

圖8 Cc_GH9的功能結構域分析Fig.8 Functional domain analysis of CC_GH9

2.9 Cc_GH9的系統(tǒng)發(fā)育和基序分析

使用MAGA-X 對Cc_GH9及其在擔子菌、結合菌、植物、動物和細菌中的同源蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)育分析（圖9A），可以看出GH9蛋白的系統(tǒng)發(fā)育基本與其物種分類具有一致性，可以分為真核生物和原核生物組，原核生物酸熱脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）的GH9成員（ACV59481.1）單獨為一支，可以看作該發(fā)育樹的外群，但是嗜熱醋弧菌（Acetivibrio thermocellus）的GH9蛋白（BAB33148.1）卻與動物組的GH9成員聚為一支.真核生物GH9成員按照“界”分類地位（真菌界、植物界、動物界）可以分為三大支，真菌GH9成員又包括擔子菌和結合菌的GH9成員，植物和動物的GH9成員進化關系較近，可以聚為一大支與真菌GH9成員并列，然而在接合菌卷枝毛霉（Mucor circinelloides）的GH9蛋白（EPB83463.1）未和其他真菌GH9成員聚為一支，卻和動物和植物的GH9成員聚為一支.除小鬼傘Coprinellus angulatus和平田頭菇Agrocybe pediades中含有2個GH9蛋白，絕大多數(shù)擔子菌中僅含有1個GH9蛋白，而結合菌M.circinelloides則含有4個GH9蛋白.擔子菌GH9成員的系統(tǒng)發(fā)育基本與物種的系統(tǒng)發(fā)育一致，如小鬼傘屬和擬鬼傘屬中兩個GH9蛋白對應兩個種，Cc_GH9與擬鬼傘C.marcescibilis的GH9蛋白（TFK29350.1）親緣關系最近，其次是小鬼傘屬，與美味牛肝菌（Boletus edulis）的GH9蛋白（KAF8138651.1）親緣關系最近.

圖9 Cc_GH9的系統(tǒng)發(fā)育（A）及其基序分析（B）Fig 9 Phylogenetic analysis of Cc_GH9（A）and its motif analysis（B）

使用MEME分析了Cc_GH9系統(tǒng)發(fā)育分析所用的GH9蛋白成員氨基酸序列中的基序（圖9B），大多數(shù)GH9蛋白均含有-ENAYVLYGAVVGGPDKRDRFYDIRSDWPQTEVALDYNAPLL-、-LTGGYYDAGDYSKFT?FPLSFTLMSJCWGATDFGKGYDLANQ-和- YWGGDRSIPTPRPVYQINDTNPGTDAAAGTAAAFAACSNLY-等3個基序，在卷枝毛霉M.circinelloides（EPB83463.1）、嗜熱醋弧菌屬A.thermocellus（BAB33148.1）、擬南芥Arabidopsis thaliana（AAC83240.1）和陸地棉Gossypium hirsutum（AAP83128.1）中缺少基序3，而酸熱脂環(huán)酸桿菌Alicyclobacillus acidocaldarius（ACV59481.1）中沒有以上3 個基序，故和其他GH9 蛋白差異較大，進化樹中起到外群的角色.

3 討論

大部分蕈菌營腐生型營養(yǎng)方式，能夠分泌胞外酶降解大分子的蛋白和多糖生成氨基酸、葡萄糖等能直接吸收利用的小分子物質，其中分泌的纖維素酶能夠將基質中的纖維素組分降解為葡萄糖.灰蓋擬鬼傘是最早基因組測序的傘菌之一，并且作為模式生物，在孢子減數(shù)分裂、菌柄伸長生長以及菌蓋自水解等方面有著廣泛研究［26］.灰蓋擬鬼傘的生長周期短，經(jīng)常被當作食用菌生產(chǎn)過程中的雜菌，如與草腐菌草菇或雙孢蘑菇競爭營養(yǎng)，因此，鬼傘能夠高效利用秸稈等基質中的纖維素組分.對灰蓋擬鬼傘纖維素酶的研究主要集中在GH6家族的β-葡聚糖酶，日本學者對CcCel6C進行了異源重組表達，并對其晶體結構進行了表征分析［27，28］.灰蓋擬鬼傘中含有5個GH6蛋白（CcCel6A，CcCel6B，CcCel6C，CcCel6D和CcCel6E）基因，經(jīng)檢索灰蓋擬鬼傘基因組中僅含有1個GH9蛋白基因.已有文獻表明，GH9蛋白主要存在于細菌、植物中，偶爾也存在于動物中，在真菌中研究較少.棉花內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶（EG17）屬于GH9家族蛋白，在植物器官的的脫落過程中發(fā)揮一定作用，劉康永等人對其基因進行了克隆和生物信息學分析［29］，EG17編碼基因為1533bp，與本研究Cc_GH9編碼基因大小相近；EG17二級結構也主要以無規(guī)則卷曲為主，也與本研究Cc_GH9類似.王麗珊對擬南芥和水稻的GH9家族纖維素酶進行了生物信息學分析［30］，這些蛋白大多為穩(wěn)定蛋白，二級結構主要是無規(guī)則卷曲和α-螺旋，大部分是分泌蛋白，這與本研究Cc_GH9 相似，說明GH9 家族蛋白存在保守性，但它們的亞細胞定位于細胞膜或細胞壁，而本研究Cc_GH9定位于胞外.并非所有真菌都含有GH9家族蛋白編碼基因，Hüttner等分析了微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）FCH 5.7的基因組，預測獲得2個GH9蛋白編碼基因［31］，大部分擔子菌中含有1個該基因，子囊菌中沒有該基因［32］.對于真菌GH9蛋白的生理功能目前仍不清楚.對擔子菌黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的有關研究表明，GH9可能與結晶纖維素的降解有關，當P.chryso?sporium在纖維素上生長時，GH9基因表達上調［32］.

內(nèi)切葡聚糖酶隨機水解纖維素鏈的內(nèi)部位點，隨后產(chǎn)生不同長度的寡糖，其活性位點形貌特征為一“裂縫”（cleft）或“凹槽”（groove），其開放的表面允許纖維素鏈中的若干糖單元隨機結合［33］.本研究中Cc_GH9的三級預測結構的表面格式（圖9B）可以看出，其催化結構域為一“裂縫”.GH9家族內(nèi)切葡聚糖酶通過異頭立體化學的反轉完成催化反應，含有1個保守谷氨酸（Glu）殘基作為催化廣義酸以及結合催化水的2個保守天冬氨酸（Asp）殘基，其中一個作為催化廣義堿［34］.已報道的GH9蛋白催化域結構含有一個（α/α）6折疊桶結構，包含一個至少含有6個糖結合位點（-4到+2）的開放活性位點裂縫［35，36］.通常持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶都包含一個3c CBM結構，但是灰蓋擬鬼傘Cc_GH9中缺失該結構域，因此，推測其對結晶纖維素不具有水解活性或者具有微弱水解活性.此外，Cc_GH9在Glyco_hydro_9保守結構域中存在60位氨基酸的缺失，可能導致其結構和活性較其他真菌GH9蛋白不同.通過本研究可以為Cc_GH9基因的克隆及重組表達研究提供指導，比如檢測重組蛋白是否具有水解活性，應當選擇可溶性底物，如羧甲基纖維素或者纖維寡糖等，而不選不溶性的結晶纖維素等作為底物.通過對Cc_GH9的生物信息學預測分析，為灰蓋擬鬼傘纖維素酶的開發(fā)利用提供新的思路.