彭麗娟 任俊奇

(1武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院婦科，湖北 武漢 430040；2武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科)

宮頸癌多發(fā)于中年婦女〔1～3〕，嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量及生命安全，早期篩查和診斷并盡早介入治療，是降低宮頸癌死亡率的關(guān)鍵。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可以通過作用于靶基因調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、等代謝活動。研究發(fā)現(xiàn)，miR-335可能在宮頸癌發(fā)病中發(fā)揮類似抑癌基因的作用，但其對下游靶基因的調(diào)控機(jī)制尚未明確〔4〕。激活轉(zhuǎn)錄因子(ATF)2屬于堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族，研究發(fā)現(xiàn)〔5〕，ATF2靶基因包括c-Jun、腫瘤壞死因子(TNF)α、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)A等，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。然而，關(guān)于ATF2在宮頸癌中相關(guān)研究還未見，因此本研究通過檢測miR-335-5p和轉(zhuǎn)錄因子ATF2在宮頸癌組織和健康宮頸組織中的表達(dá)水平，探究其表達(dá)特點(diǎn)并分析臨床意義。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本及臨床資料 從2014年3月至2016年3月在武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院存檔的宮頸組織石蠟包埋標(biāo)本中隨機(jī)選取150例，均為手術(shù)標(biāo)本，其中宮頸癌組織75例，均為成年女性，且術(shù)前均未接受放化療或其他抗腫瘤治療。年齡35～64歲，平均年齡(50.58±7.62)歲；2000年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟臨床分期(FIGO)：Ⅰ期23例，Ⅱ期41例；Ⅲ期10例；Ⅳ期1例；鱗狀細(xì)胞癌43例，腺癌22例，鱗腺癌10例；腫瘤分化程度：高分化22例，中分化34例，低分化19例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例；腫瘤直徑：0.65～5.91 cm，平均直徑(3.54±1.68)cm。對照組75例，均來自同期接受子宮肌瘤全子宮切除術(shù)的成年女性，且未接受其他手術(shù)或藥物治療。年齡37～63歲，平均年齡(56.83±9.25)歲。實(shí)驗(yàn)組與對照組在年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn)通過，樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒，購自于北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix，購自南京vazyme生物公司；引物由上海生工生物公司等合成。qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司等；Anti-ATF2、Anti-β-actin購自abcam公司；ATF-2 (N-96) 兔多克隆抗體(sc-6233)購自美國Proteintech公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)酶底物顯色試劑盒與SP試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3qRT-PCR法檢測宮頸癌組織和健康宮頸組織miR-335-5p水平 采用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組宮頸組織中miR-335-5p表達(dá)水平。采用RNA提取試劑盒(天根)提取宮頸癌組織和健康宮頸組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用定量PCR儀(Bio-Rad)對miR-335-5p進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR體系共10 μl：miScript SYBR?Green Mix 5 μl，cDNA(50 ng/μl)1μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反應(yīng)條件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；40個循環(huán)。miR-335-5p正向引物:5′-GAGTTGACCACAGCACCTC-3′,反向引物5′-GAGACAGTTCTCGTTATTGC-3′;U6正向引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。采用2-ΔΔCt法對miR-335-5p表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.4Western印跡法檢測AFT2蛋白表達(dá)情況 提取實(shí)驗(yàn)組與對照組組織總蛋白，并測定蛋白總量。以β-actin蛋白作為內(nèi)參，采用Western印跡法檢測ATF2蛋白表達(dá)情況，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。利用Lab Works對檢測條帶定量分析，測定條帶光密度，ATF2蛋白相對表達(dá)量=ATF2蛋白光密度值/β-actin蛋白光密度值。

1.5免疫組化染色 采用免疫組化法檢測各組織標(biāo)本中ATF2的表達(dá)水平。主要操作步驟如下：①將宮頸組織標(biāo)本采用石蠟切片機(jī)切成厚度為4 μm的切片，展片后于60℃烘烤1 h；②將切片依次置于二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中進(jìn)行常規(guī)脫蠟至水；③通過在pH6.0濃度為0.01 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液中煮沸18 min進(jìn)行抗原熱修復(fù)；④在切片上滴加3%過氧化氫，于室溫孵育10 min滅活組織中的內(nèi)源性過氧化物酶；⑤采用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗切片3 min×3次，滴加1%的牛血清白蛋白，孵育50 min封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；⑥吸棄封閉液(陰性對照除外)，滴加預(yù)先按說明書1∶200比例稀釋的兔多克隆抗體ATF2，置于濕盒中4℃孵育過夜；⑦PBS沖洗切片3次，每次5 min，加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37℃孵育40 min。⑧PBS沖洗切片5 min×3次，常規(guī)DAB顯色，并采用10%的蘇木素進(jìn)行復(fù)染；⑨將切片依次置入70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中進(jìn)行梯度脫水，置于二甲苯中透明，并采用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察拍照。

1.6結(jié)果判定 免疫組化染色結(jié)果中ATF2蛋白以胞核或胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。采用Bresalier雙評分半定量法對免疫組化陽性結(jié)果進(jìn)行判定，即由陽性腫瘤細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度共同決定，其中染色強(qiáng)度評分：0分(無染色)，1分(弱染色，淺黃色)，2分(中染色，黃褐色)，3分(強(qiáng)染色，棕褐色)；陽性腫瘤細(xì)胞所占比例評分：0分(<25%)，1分(25%～50%)，2分(51%～75%)，3分(>75%)。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占比例的評分乘積即為染色指數(shù)(SI)，每個標(biāo)本的評估均由3名專業(yè)人員進(jìn)行評定取平均值，SI評分為0～9分，其中SI≤1分為陰性(-)；1分

1.7隨訪 對所有治療出院后的患者每3個月進(jìn)行復(fù)查或電話隨訪，隨訪時間為36個月，末次隨訪時間截止2019年3月1日，死亡患者以死亡時間作為隨訪截止期，本次隨訪的中位隨訪時間為30個月。觀察記錄患者隨訪期間腫瘤復(fù)發(fā)情況、生存情況。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用軟件SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-335-5p在宮頸癌組織、對照組中表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)組miR-335-5p表達(dá)相對于對照組顯著下調(diào)(0.68±0.12 vs 1.03±0.19;P<0.05)。

2.2Western印跡法檢測ATF2蛋白表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)組ATF2蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(0.96±0.02 vs 0.23±0.05;P<0.05)。

2.3ATF2在對照組及實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組ATF2的陽性表達(dá)率(53.33%，+16例、21例、3例)顯著高于對照組(4.00%，+2例、1例，χ2=44.632，P=0.000)。

2.4miR-335-5p和ATF2表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系 宮頸癌患者miR-335-5p表達(dá)水平與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和人乳頭瘤病毒(HPV)感染有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、FIGO分期、病理分型和腫瘤直徑無明顯相關(guān)性(P>0.05)；宮頸癌患者中ATF2表達(dá)水平與FIGO分期、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤直徑、病理類型和HPV感染無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

2.5miR-335-5p、ATF2與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系 宮頸癌組織中miR-335-5p低表達(dá)的患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率及死亡率均顯著高于miR-335-5p高表達(dá)組(P<0.05)；宮頸癌組織中ATF2高表達(dá)的患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率及死亡率均顯著高于ATF2低表達(dá)組(P<0.05)，見表1。

表1 miR-335-5p和ATF2與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系(n，n=75)

3 討 論

宮頸癌發(fā)病原因有許多，常見病因?yàn)镠PV感染〔6〕，因此通過注射HPV疫苗或HPV感染源篩選預(yù)測罹患宮頸癌風(fēng)險，是降低宮頸癌死亡率的有效方法。宮頸癌多發(fā)于中年婦女，近年呈年輕化趨勢，宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的應(yīng)用使宮頸癌患者得以盡早發(fā)現(xiàn)確診，介入治療，但是細(xì)胞學(xué)篩查方法依靠檢測人員的主觀判斷，具有一定局限性，尋找分子生物學(xué)方法更有利于宮頸癌患者的精確篩選。

miRNA沒有編碼蛋白質(zhì)的作用，但能夠通過和靶基因mRNA結(jié)合抑制其翻譯或者直接使其降解，達(dá)到在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因表達(dá)的作用〔7〕。miR-335-5p屬于miR-335家族，位于染色體7q32.2，miR-335-5p在許多研究中已被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及化療耐藥等密切相關(guān)〔8～10〕。研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，miR-335-5p在骨肉瘤、肝癌、甲狀腺癌及胃癌等惡性腫瘤中表達(dá)水平較低，能抑制腫瘤細(xì)胞持續(xù)的生長和轉(zhuǎn)移。秦海霞等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)miR-335在宮頸癌細(xì)胞系SiHa中表達(dá)顯著降低，可抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲及遷移。與以上結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)miR-335-5p在宮頸癌中表達(dá)顯著下調(diào)，說明miR-335-5p可能與宮頸癌有關(guān)。張梨虹等〔13〕通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，8-氯腺苷(Cl-Ado)可以通過下調(diào)RNA特異性腺苷脫氨酶(ADAR)1負(fù)向調(diào)控miR-335-5p抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，miR-335-5p在乳腺癌中可能作為抑癌基因。本研究結(jié)果說明miR-335-5p可能參與宮頸癌的發(fā)展過程，miR-335-5p的表達(dá)水平降低可能與宮頸癌復(fù)發(fā)、死亡等不良預(yù)后有關(guān)。

活化轉(zhuǎn)錄因子(ATF)2位于人14號染色體，ATF2的過表達(dá)能夠抑制細(xì)胞周期抑制因子P21、P27的表達(dá)，促進(jìn)原癌基因CyclinD1的激活〔14〕，Li等〔15〕研究證實(shí)宮頸癌細(xì)胞中ATF表達(dá)量高于正常宮頸細(xì)胞，過表達(dá)miR-204可下調(diào)ATF表達(dá)量，是治療宮頸癌的理想靶點(diǎn)。與其研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中ATF2表達(dá)水平顯著高于健康宮頸組織，提示ATF2可能與宮頸癌病變有關(guān)。王成等〔16〕研究顯示，ATF-2是ATF/腺苷酸環(huán)化酶(CAMP)反應(yīng)成分結(jié)合蛋白家族成員，具有生長因子非依賴性增殖和轉(zhuǎn)化能力。劉建云等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)ATF2可激活在腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常活躍的泛素水解酶22啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究結(jié)果提示ATF2可能與宮頸癌患者病情發(fā)展有關(guān),ATF2高表達(dá)可能與宮頸癌患者不良預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，宮頸癌組織miR-335-5p相對于健康宮頸組織表達(dá)下調(diào)、ATF2表達(dá)上調(diào)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度等臨床病理特征及術(shù)后復(fù)發(fā)生存情況有關(guān)，本研究未對miR-335-5p、ATF2與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中的具體作用關(guān)系進(jìn)一步探索，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中借助細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行完善。