董明杰 周艷 段沫 高慶敏 趙建輝

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 1普外七科，河北 石家莊 050000；2檢驗(yàn)科；3石家莊市正定縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，也是世界第三高發(fā)惡性腫瘤，位于肺癌、乳腺癌之后。近十年數(shù)據(jù)顯示，隨著時(shí)間變化結(jié)直腸癌發(fā)病和死亡呈現(xiàn)上升趨勢，因此降低結(jié)直腸癌發(fā)病與死亡仍是世界性的共同問題〔1〕。2018年結(jié)直腸癌診療指南中明確指出，應(yīng)將結(jié)直腸癌患者納入多學(xué)科寫作(MDT)管理，實(shí)施整體治療策略，因此有必要尋找新的標(biāo)志物，并與目前結(jié)直腸癌患者臨床生物學(xué)行為系統(tǒng)聯(lián)合，以期為臨床進(jìn)行評估和診斷提供有效信息〔2〕。

T-box3基因(TBX3)屬于T-box家族，在脊椎和非脊椎動(dòng)物胚胎的形態(tài)和組織發(fā)生中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、宮頸癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中檢測出TBX3高表達(dá)〔3～6〕，但其作用及其機(jī)制尚不清楚。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的一個(gè)重要分子機(jī)制，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到重視。本研究檢測TBX3和EMT相關(guān)分子在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，探討TBX3蛋白在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用，并分析兩兩之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年10月至2018年9月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院普外七科住院手術(shù)的68例結(jié)直腸癌患者為研究對象，取結(jié)直腸腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行研究檢測，并完善病理資料。結(jié)直腸患者男41例，女27例，平均年齡(54.86±12.05)歲，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 TBX3兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin)20、波形蛋白(Vimentin)、TBX3引物及內(nèi)參基因GAPDH引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3Western印跡檢測 取結(jié)直腸患者腫瘤組織及癌旁組織100 mg，細(xì)胞裂解液裂解，Bradford法測定組織細(xì)胞總蛋白，50 μg總蛋白液中加入聚丙烯酰胺凝膠緩沖液，水浴3～5 min進(jìn)行蛋白變性，上樣，進(jìn)行凝膠電泳分離，半干法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%牛奶室溫封閉、加入TBX3一抗或內(nèi)參β-actin一抗孵育過夜，洗膜后室溫用辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗孵育反應(yīng)，充分洗膜后顯影曝光，對條帶進(jìn)行吸光度掃描，以目的蛋白/β-actin比值為相對表達(dá)量，進(jìn)行半定量分析。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 取結(jié)直腸患者腫瘤組織及癌旁組織100 mg，進(jìn)行qRT-PCR檢測。具體步驟如下：PCR試劑盒提取腫瘤組織及癌旁組織的總RNA，鑒定其濃度和純度，進(jìn)一步利用試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行Real time PCR，檢測目的基因mRNA表達(dá)水平。qPCR 反應(yīng)引物序列見表1，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 15 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本目的基因的循環(huán)閾值 Ct 用內(nèi)參基因GAPDH來校正，以2-ΔΔCt方法分析目的基因的mRNA相對表達(dá)水平。

表1 PCR 引物序列

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)直腸癌患者TBX3蛋白及mRNA表達(dá)情況 結(jié)直腸癌患者腫瘤標(biāo)本組織中TBX3蛋白及mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織(均P<0.001),見表2。

表2 結(jié)直腸癌患者TBX3蛋白和TBX3 mRNA表達(dá)

2.2結(jié)直腸癌患者E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表達(dá) 結(jié)直腸癌患者腫瘤標(biāo)本組織中Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織，E-cadherin mRNA表達(dá)明顯低于癌旁組織(均P<0.001)，見表3。

表3 結(jié)直腸癌患者E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表達(dá)

2.3結(jié)直腸癌患者TBX3表達(dá)與E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin表達(dá)的關(guān)系 將結(jié)直腸癌患者進(jìn)行二次分組，分為高TBX3蛋白表達(dá)組、低TBX3蛋白表達(dá)組，結(jié)果顯示高TBX3表達(dá)組Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表達(dá)明顯高于低TBX3表達(dá)組，E-cadherin mRNA表達(dá)明顯低于低TBX3表達(dá)組(均P<0.001)，見表4。

表4 結(jié)直腸癌患者E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表達(dá)

2.4結(jié)直腸癌患者TBX3、E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系 TBX3、E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P<0.001)，見表5。

表5 結(jié)直腸癌患者TBX3、E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.5結(jié)直腸癌患者TBX3與E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin表達(dá)的相關(guān)性 腫瘤組織中TBX3與Cytokeratin 20(r=0.757)、Vimentin(r=0.677)呈正相關(guān)，TBX3與E-cadherin(r=-0.717)呈負(fù)相關(guān)(均P<0.001)。

3 討 論

TBX3是TBX基因家族的成員之一，該家族屬發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因家族，在脊椎和非脊椎動(dòng)物胚胎的形態(tài)和組織中發(fā)揮著重要作用〔7〕。研究表明，在不同的腫瘤組織和細(xì)胞株中可檢測到TBX3過表達(dá)，如乳腺癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、肉瘤和宮頸癌等，TBX3異常高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)〔8，9〕。Feng等〔10〕采用免疫印跡法技術(shù)檢測新鮮結(jié)直腸癌及相應(yīng)的癌旁組織TBX3 表達(dá)的情況，發(fā)現(xiàn) TBX3 基因在癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織。本研究結(jié)果提示結(jié)直腸癌患者中TBX3高表達(dá)。進(jìn)一步對TBX3表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床病理因素進(jìn)行分析，TBX3與結(jié)直腸癌臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，臨床分期晚、分化程度高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者腫瘤組織TBX3表達(dá)越高。

EMT與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是惡性腫瘤細(xì)胞獲得較強(qiáng)侵襲及遷移能力等惡性行為的重要生物學(xué)過程，處于EMT 的上皮細(xì)胞在經(jīng)歷短暫的結(jié)構(gòu)改變后極性喪失，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的接觸減少，細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，上皮細(xì)胞表型如E-cadherin及Cytokeratin等蛋白表達(dá)丟失，而表達(dá)一些間質(zhì)細(xì)胞表型如 Vimentin、Fibronectin及 N-cadherin 等〔11～15〕。本研究結(jié)果表明，EMT相關(guān)蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生與發(fā)展中表達(dá)的變化具有一定的生物學(xué)意義，EMT相關(guān)蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與性別、年齡無明顯關(guān)系。

本研究結(jié)果提示TBX3表達(dá)變化與結(jié)直腸癌EMT有關(guān)，高TBX3表達(dá)可促使結(jié)直腸癌浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移。