晏僖，楊小楓

癲癇是腦部神經(jīng)元高度同步化異常放電引起的慢性疾病。目前癲癇的患病率為1%，其中30%的患者為藥物難治性癲癇，部分藥物難治性癲癇患者可以選擇手術(shù)治療，但仍有相當(dāng)部分的患者手術(shù)療效不佳或缺乏手術(shù)適應(yīng)證[1]；因此，不斷出現(xiàn)新的治療方法[2]。近年來精準(zhǔn)醫(yī)療已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢。過去二十年，光遺傳學(xué)及化學(xué)遺傳學(xué)因為能夠特異性地調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，已經(jīng)被引入到癲癇治療的研究之中。另外，不依賴光照裝置植入的非侵襲性的優(yōu)點，使得化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)在臨床轉(zhuǎn)化上更具有前景[3]。化學(xué)遺傳學(xué)是一種通過改造生物大分子物質(zhì)，使其能與先前無法識別的小分子化學(xué)激動劑相互作用的方法[4]。目前已成功改造的大分子包括：蛋白質(zhì)激酶、代謝酶、配體門控性離子通道和G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)等[2]?；贕PCRs改造的，只由特定藥物激活的受體(designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs)技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)?，F(xiàn)對DREADDs技術(shù)的機制及其在癲癇治療中的研究現(xiàn)狀綜述如下，并對該技術(shù)今后的臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)行展望。

1 DREADDs技術(shù)

2007年，Roth和Armbruster等首次報道了DREADDs技術(shù)。其團隊通過對酵母的人毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3亞型(human M3 muscarinic receptor,hM3)進(jìn)行數(shù)輪隨機誘導(dǎo)突變并進(jìn)行篩選，從而得到不能與乙酰膽堿結(jié)合的受體。但這一受體可與納摩爾濃度級別的氯氮平的氮氧化物(clozapine-N-oxide,CNO)結(jié)合。該受體具有Y3.33C和A5.46G兩個氨基酸位點突變。CNO作用于該受體后激活類似乙酰膽堿作用于M3受體的Gq信號通路，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，在成熟神經(jīng)元中產(chǎn)生去極化，引起細(xì)胞興奮性增加，因此被命名為hM3Dq[5]。選擇CNO作為該突變受體的化學(xué)激動劑進(jìn)行篩選，是考慮到CNO的母體化合物氯氮平具有與M3受體的高親和性、良好的血-腦屏障穿透性、藥代動力學(xué)特性，以及CNO在生理條件下的藥理學(xué)惰性。這些優(yōu)點使其成為理想的DREADDs配體[6]。由于Y3.33和A5.46在不同的人毒蕈堿受體亞型中的保守性，該團隊陸續(xù)研發(fā)出一系列基于毒蕈堿受體的DREADDs家族成員(hM1Dq、hM2Di、hM3Dq、hM4Di和hM5Dq)[5]。其中hM1Dq、hM3Dq和hM5Dq可與Gq蛋白α亞單位(Gq protein α subnit，Gαq)結(jié)合，激活Gq信號通路，調(diào)動細(xì)胞內(nèi)Ca2+，引起細(xì)胞興奮性增高；其中hM3Dq常作為增強神經(jīng)細(xì)胞放電的有力工具[7]。hM2Di和hM4Di與Gi受體(對腺苷酸環(huán)化酶有抑制作用的受體)結(jié)合，激活Gi信號通路，引起G蛋白內(nèi)向整流性鉀離子通道(G-protein inwardly rectifying potassium channels,GIRKs)開放，引起細(xì)胞超極化，減少神經(jīng)細(xì)胞自發(fā)性放電活動[5]。因此hM4Di在非侵襲性的靜默神經(jīng)細(xì)胞的離體或在體實驗中被廣泛使用[8]。為進(jìn)一步擴展DREADDs庫，Guettier等研發(fā)了選擇性激活Gs信號通路的Gs-DREADDs，從而激活cAMP介導(dǎo)的信號通路，引起細(xì)胞興奮性增高。但與hM3Dq及hM4Di不同的是，Gs-DREADDs能夠在一些細(xì)胞中表現(xiàn)出一定的活性，這限制了該受體的廣泛使用[9]。2012年，基于β-arrestin的DREADDs技術(shù)也被報道。該受體可以在體外激活β-arrestin通路，但是該受體完全激活依賴高濃度的CNO，從而影響該受體的使用[10]。

將DREADDs轉(zhuǎn)染到特異類型的細(xì)胞上需要借助慢病毒、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)或改良的單純皰疹病毒(modified herpes simplex viruses,HSVs)等病毒載體。目前最常使用的主要有三種方法：(1)借助組織特異性啟動子攜帶DREADDs基因通過病毒載體，使DREADDs表達(dá)在特定位置特異類型的細(xì)胞上[9]；(2)借助Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)的特異性，通過注射攜帶DREADDs基因的FLEX開關(guān)(反向雙開放讀碼框，double-inverted open reading frame,DIO)的病毒載體轉(zhuǎn)染到Cre轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)，使DREADDs只表達(dá)在Cre表達(dá)的細(xì)胞上[11]；(3)利用改造的單純皰疹病毒的投向特異性，從而聯(lián)合使用表達(dá)Cre重組酶的逆向示蹤狂犬腺病毒(canine adenovirus,CAV)，即CAV-Cre和帶有FLEX-DREADDs的AAV(如AAV-FLEX-hM3Dq)。由于CAV的逆向投射作用，位于軸突投射區(qū)的CAV-Cre能夠逆行到轉(zhuǎn)染了FLEX-DREADDs病毒的神經(jīng)元胞體，通過Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)的特異性，DREADDs只表達(dá)在發(fā)出該投射的神經(jīng)元細(xì)胞膜上[12]。該逆向示蹤功能使其成為神經(jīng)環(huán)路研究的有力工具，使得精準(zhǔn)調(diào)控目標(biāo)腦區(qū)特定投射的神經(jīng)元成為可能。

CNO是DREADDs 經(jīng)典的化學(xué)激動劑，是非典型抗精神病藥物氯氮平的藥源性惰性代謝產(chǎn)物。許多實驗證實，CNO在推薦劑量(0.1～0.3 mg/kg)下在小鼠或大鼠體內(nèi)具有惰性，并不出現(xiàn)藥理學(xué)和行為學(xué)的影響[13]。但有實驗表明CNO在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成氯氮平[14]；而氯氮平對DREADDs受體具有更強的親和力和作用效果[15]。低閾值濃度的氯氮平(0.1 mg/kg)可以產(chǎn)生與10 mg/kg CNO相同的作用效果[15]。氯氮平是已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)的臨床用藥，主要用于抗精神病的治療，具有明確的藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)特性以及已知的不良反應(yīng)，并且其選擇性激活DREADDs受體所需要的濃度非常低。Weston團隊研究發(fā)現(xiàn)低劑量濃度的奧氮平(一種抗精神病藥物)也可以作用于hM4Di受體[16]。這些發(fā)現(xiàn)使DREADDs技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化更具有前景。

2 DREADDs技術(shù)在癲癇治療中的研究

2005年Boyden團隊首次報道了光遺傳學(xué)技術(shù)可將光敏感性蛋白表達(dá)在特定的細(xì)胞上，利用特定波長的光線激活，從而實現(xiàn)對神經(jīng)活動毫秒級別的精細(xì)調(diào)控[17]?；瘜W(xué)遺傳學(xué)技術(shù)具有與光遺傳相似的細(xì)胞選擇性的調(diào)控神經(jīng)元興奮性的功能，同時又比光遺傳學(xué)技術(shù)有一些明顯優(yōu)勢，使之更利于臨床轉(zhuǎn)化。這些優(yōu)勢為：(1)化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)不需要植入光纖，因此不會對腦組織造成損傷，亦不會引起光毒性；(2)由于化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)可以經(jīng)過系統(tǒng)給受體激動劑，故可以對于多個致癇灶以及大面積的致癇灶進(jìn)行控制；(3)相比光遺傳學(xué)技術(shù)對裝置的依賴，化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)使用的CNO具有生物親和性，其多種給藥途徑(如靜脈注射、口服、腹腔注射)使得DREADDs技術(shù)更加簡便可行；(4)相較于光遺傳學(xué)對神經(jīng)活動毫秒級別的控制，化學(xué)遺傳學(xué)能夠產(chǎn)生長時程的興奮或抑制，更加有利于癲癇的治療[3]。

2014年，K?tzel等[18]首次報道了DRADDs技術(shù)可用于癲癇治療研究。該實驗采用匹魯卡品和苦味素大鼠急性皮層癲癇模型及破傷風(fēng)毒素的慢性皮層癲癇模型，用載有hM4D(Gi)的AAV，通過CaMKⅡa啟動子將該受體特異性地表達(dá)在運動皮層第5層的錐體細(xì)胞上。結(jié)果顯示，1 mg/kg的CNO經(jīng)腹腔注射后可以明顯降低癲癇的發(fā)作頻率和能量，緩解癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度。同時該實驗組使用膜片鉗技術(shù)實驗發(fā)現(xiàn)，將CNO作用于轉(zhuǎn)染了hM4Di的海馬腦片上能可逆性地抑制突觸興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。這提示化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)可能會成為控制皮層癲癇發(fā)作的新方法。2016年Avaliani等報道了CNO作用于表達(dá)hM4Di的海馬腦片上可引起細(xì)胞超極化，抑制癲癇樣放電[19]。Akerman等[20]用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)的特異性離體腦片和在體癲癇模型研究表明，海馬中間神經(jīng)元這一抑制系統(tǒng)的激活可以在原位抑制癲癇樣同步化放電。2018年，Darwin等[21]研究報道，海馬神經(jīng)干細(xì)胞移植能夠減少顳葉癲癇的慢性發(fā)作；同時，用化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)選擇性地將分化成的中間神經(jīng)元抑制后，癇樣放電增加；從而表明神經(jīng)干細(xì)胞移植是治療顳葉癲癇非常有前景的方法。這些結(jié)果證明了用化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)通過抑制癲癇起始區(qū)的錐體神經(jīng)元或激活中間神經(jīng)元，可以抑制癇性放電，從而達(dá)到控制癲癇發(fā)作的效果。

Wicker等[13]使用杏仁核點燃的顳葉癲癇模型，用攜帶hM4D(Gi)基因的AAV，通過hsyn啟動子將該受體表達(dá)在丘腦中縫核群和板內(nèi)核群的神經(jīng)元(包括興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元)上；結(jié)果顯示CNO可以明顯抑制癲癇的腦電和行為學(xué)發(fā)作。陳忠實驗組[22]在Vgat-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬下托(subiculum)注射載有hM3Dq的AAV，借助Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)的特異性，將該受體特異性地表達(dá)在海馬下托的中間神經(jīng)元上。實驗結(jié)果顯示，海人酸誘導(dǎo)的急性顳葉癲癇模型注射CNO后可以減輕癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度，延長癲癇發(fā)作的潛伏期，并減少全面性發(fā)作的次數(shù)。進(jìn)一步地，該團隊利用光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)選擇性抑制海馬下托錐體神經(jīng)元的興奮性，從而逆轉(zhuǎn)了苯妥英鈉耐藥性顳葉癲癇，而將錐體神經(jīng)元選擇性激活則直接誘導(dǎo)耐藥形成；這表明了海馬下托錐體神經(jīng)元對于顳葉癲癇耐藥的形成具有重要的“門控”作用[23]。Berglind等于2018年報道了將hM4Di受體表達(dá)在對側(cè)的海馬，能夠減弱同側(cè)海馬的后放電，證明了對側(cè)海馬在顳葉癲癇進(jìn)展中的重要作用[24]。Suh研究發(fā)現(xiàn)，用CNO特異性地作用于海馬齒狀回新生顆粒細(xì)胞的hM4Di可以明顯地降低匹魯卡品誘導(dǎo)的慢性顳葉癲癇的癇性放電和自發(fā)性癲癇發(fā)作；并且用CNO特異性地作用于海馬齒狀回新生顆粒細(xì)胞的hM3Dq受體，能夠顯著地增加匹魯卡品誘導(dǎo)的慢性顳葉癲癇的癇性放電和自發(fā)性癲癇發(fā)作[25]；表明海馬齒狀回新生的顆粒細(xì)胞對癇性環(huán)路的形成起著重要的作用，是癲癇治療的潛在靶點。以上研究結(jié)果提示化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)可以通過抑制癇性環(huán)路中某一靶點的興奮性，在癲癇傳播過程中控制顳葉癲癇的發(fā)作；同時表明丘腦中縫核群、海馬下托、對側(cè)海馬，以及在癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬齒狀回新生的顆粒細(xì)胞是有效控制顳葉癲癇發(fā)作的靶點。

綜上所述，盡管DREADDs技術(shù)在癲癇治療領(lǐng)域中的探索仍處于初步階段，但已有的離體組織及癲癇動物模型實驗結(jié)果表明該技術(shù)都能有效地控制癲癇活動。

3 DREADDs技術(shù)在癲癇治療的展望

3.1 癲癇起始和傳播過程中局部和遠(yuǎn)程的調(diào)控 目前癲癇的治療可以大致分為兩種策略：(1)直接地或通過局部環(huán)路調(diào)控癲癇起始區(qū)的興奮性；(2)通過對丘腦-皮層-基底節(jié)網(wǎng)絡(luò)中某些靶點的遠(yuǎn)程調(diào)控，影響癲癇在這些通路上的傳播[26]?；谕瑯又委煵呗缘哪X深部刺激(deep brain stimulation,DBS)已經(jīng)在臨床癲癇治療應(yīng)用中有著較長的歷史[27]。

癲癇的起始和傳播與腦網(wǎng)絡(luò)形成的環(huán)路密切相關(guān)。如海馬-乳頭體-丘腦前核-扣帶回-海馬的Papez環(huán)路與顳葉癲癇的起始與擴散有關(guān)[28]，而皮質(zhì)-丘腦-皮質(zhì)環(huán)路與失神癲癇關(guān)系密切[29]。目前的研究已經(jīng)證明這些環(huán)路中的海馬[30]、丘腦前核[31]，以及小腦的抑制性傳出通路浦肯野纖維[32]是癲癇治療的有效靶點。因此調(diào)節(jié)神經(jīng)環(huán)路結(jié)點的興奮性對于控制癲癇的起始和傳播具有重要的作用；而發(fā)現(xiàn)能夠控制各種類型癲癇發(fā)作的關(guān)鍵節(jié)點，對有多個致癇灶而不能進(jìn)行手術(shù)的患者，以及致癇灶位于功能區(qū)的藥物難治性癲癇患者均具有非常重要的意義。

3.2 錐體神經(jīng)元和中間神經(jīng)元興奮性選擇性的調(diào)節(jié) 盡管癲癇產(chǎn)生的機制尚不完全清楚，但是其與神經(jīng)元興奮性和抑制性的不平衡是密切相關(guān)的，這一理念被普遍認(rèn)可[33]。已有許多證據(jù)表明興奮性的錐體神經(jīng)元與抑制性的中間神經(jīng)元的相互作用對癲癇的產(chǎn)生具有重要意義。離體大鼠海馬腦片錐體神經(jīng)元和中間神經(jīng)元的同步性全細(xì)胞記錄顯示，在癲癇發(fā)生的不同時期這兩種類型的神經(jīng)元激活的時間不同；中間神經(jīng)元在癲癇起始時更加活躍然后出現(xiàn)去極化阻滯，此時錐體神經(jīng)元放電增加[34]。Huberfeld等[35]研究顯示，癲癇患者的海馬組織中錐體神經(jīng)元活動增加是將會出現(xiàn)癲癇發(fā)作，而隨著中間神經(jīng)元活性增強則癲癇發(fā)作逐漸停止。而DREADDs技術(shù)能夠特異地改變不同種類神經(jīng)元的興奮性，這一特點使其成為可對癲癇進(jìn)行精準(zhǔn)治療的又一新方法。DREADDs技術(shù)可以精準(zhǔn)地調(diào)控癲癇起始區(qū)或致癇網(wǎng)絡(luò)重要節(jié)點特異類型細(xì)胞的興奮性。從離體組織到在體實驗，應(yīng)用DREADDs技術(shù)控制不同癲癇模型(不同機制的致癇劑或腦卒中所導(dǎo)致的急、慢性局灶性皮層癲癇和顳葉癲癇模型)的研究結(jié)果顯示，其是一種有前景、可對癲癇進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控的新型治療方法。目前DREADDs已經(jīng)可以在非人靈長類動物的細(xì)胞上成功表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)電生理學(xué)特性，并出現(xiàn)行為學(xué)改變，且未出現(xiàn)毒副作用[36]。因此，化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)在癲癇治療領(lǐng)域的臨床轉(zhuǎn)化有非常好的前景。

4 DREADDs技術(shù)在癲癇治療領(lǐng)域中面臨的挑戰(zhàn)

雖然DREADDs技術(shù)在癲癇治療中的實驗研究具有一定的效果，但是將DREADDs轉(zhuǎn)染到人類細(xì)胞上還需要考慮病毒載體的安全性。目前在人體的基因治療中使用AAV已有先例，且其長期的表達(dá)并未出現(xiàn)明顯的副作用[37]。因此，盡管還需要更加長時間的臨床觀察，但AAV是最有可能實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的病毒載體。與此同時，在難治性癲癇的精準(zhǔn)治療中，其他方法的基因治療的臨床試驗，如將電壓門控性鉀離子通道—Kv1.1通過病毒轉(zhuǎn)染到腦組織，從而降低神經(jīng)元的興奮性，進(jìn)而治療難治性癲癇，也在進(jìn)行中[38]。探測新的基因治療的安全性、耐受性的研究將為癲癇的精準(zhǔn)治療帶來新的曙光。

綜上所述，DREADDs技術(shù)能夠持久地調(diào)節(jié)GPCRs的信號通路，并具有誘導(dǎo)神經(jīng)調(diào)控的生理相關(guān)性、非侵襲性、可逆性等優(yōu)點，在癲癇治療臨床轉(zhuǎn)化中有十分光明的前景。