夏麗瓊，徐長瓊，任秋蕓，梅君，黎春輝，黎珊，唐奇，黃會(huì)保，李然

〔摘要〕 目的 研究了解張氏消腫定痛膏的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法 基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)研究張氏消腫定痛膏中化學(xué)成分，并進(jìn)行定性和相對含量分析。結(jié)果 基于廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)，檢測到張氏消腫定痛膏中有542個(gè)化合物，其中種類最多的是黃酮類化合物122種，其次為酚酸77種;脂質(zhì)的相對百分含量最高，為（24.01±4.23）%，黃酮類次之，為（17.95±3.01）%。結(jié)論 基于UPLC-MS/MS檢測平臺和MWDB數(shù)據(jù)庫，能簡單、高效檢測到張氏消腫定痛膏的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步明確其活性成分提供參考。

〔關(guān)鍵詞〕 張氏消腫定痛膏;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;黃酮;酚酸;脂質(zhì)

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.010

Material Basis Reseach of Zhangs Antiswelling and Relieving Pain Ointment

Based on UPLC-MS/MS

XIA Liqiong1， XU Changqiong2， REN Qiuyun3， MEI Jun1， LI Chunhui1， LI Shan2， TANG Qi1， HUANG Huibao1*， LI Ran2*

（1. Pharmacy Department， Yueyang Hospital of Traditional Chinese Medicine， Yueyang， Hunan 414000 China;

2. Scientific Research Institute， The Maternal and Child Health Hospital of Yueyang， Yueyang， Hunan 414000 China;

3. Medicine College， Shantou University， Shantou， Guangdong 515000 China）

〔Abstract〕 Objective To study the material basis of Zhangs antiswelling and relieving pain ointment. Methods Based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） technique， the chemical constituents in Zhangs antiswelling and relieving pain ointment were studied， and the qualitative and relative percentage analysis were conducted. Results UPLC-MS/MS detected 542 compounds were detected in Zhangs antiswelling and relieving pain ointment， among which 122 kinds of flavonoids were the most， followed by 77 kinds of phenolic acids， and the relative percentage of lipids were the highest （24.01±4.23）%， followed by （17.95±3.01）% of flavonoids. Conclusion Based on the UPLC-MS/MS technique， the chemical substance base of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment can be detected simply efficiently， which can provide reference for further defining its active ingredients.

〔Keywords〕 Zhangs antiswelling and relieving pain ointment; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; flavonoids; phenolic acids; lipid

“岳陽張氏正骨術(shù)”由張瑞林創(chuàng)立，歷經(jīng)百余年理論發(fā)展及實(shí)踐驗(yàn)證，成為湖湘中醫(yī)正骨的主流學(xué)派。2012年被國家中醫(yī)藥管理局確定為第一批全國十三大骨傷學(xué)術(shù)流派傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目，2017 年獲評“湖南省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)代表性項(xiàng)目”。

“岳陽張氏正骨術(shù)”提倡內(nèi)外相合用藥，百余年來積累了多種有效秘方，自擬自制過張氏消腫定痛膏、接骨止痛膠囊等10余種院內(nèi)制劑。張氏消腫定痛膏是張氏正骨學(xué)術(shù)流派傳承人在中醫(yī)理論及張氏正骨學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)下研制而成，由骨碎補(bǔ)、當(dāng)歸、紅花、川芎、續(xù)斷、龍血竭、王不留行、梔子、大黃等25味中藥制成，在岳陽市中醫(yī)醫(yī)院及張氏正骨學(xué)術(shù)流派工作室臨床工作中，歷經(jīng)20余年數(shù)萬例的臨床驗(yàn)證，具有行氣、活血化瘀、消腫止痛的功效，對損傷軟組織無菌性炎癥的改變、局部急性炎癥的修復(fù)具有重要促進(jìn)作用。用于治療急慢性軟組織損傷，臨床療效顯著，安全性良好[1-4]。然而，張氏消腫定痛膏治療骨傷科疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚不明確，本項(xiàng)目擬通過UPLC-MS/MS和MWDB數(shù)據(jù)庫等廣泛靶向代謝組學(xué)研究平臺，研究張氏消腫定痛膏化學(xué)成分，了解其化合物種類及相對含量，初步明確張氏消腫定痛膏發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

超高效液相色譜（Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，日本島津）;串聯(lián)質(zhì)譜（Applied Biosystems 6500 QTRAP，美國SCIEX）;BSA224S-CW型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）;甲醇、乙腈、乙醇為Merck色譜純試劑;標(biāo)準(zhǔn)品（BioBioPha/Sigma-Aldrich）;色譜柱：Agilent RRHD SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;張氏消腫定痛膏由岳陽市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科提供。

2 方法

2.1? 供試品溶液的制備

張氏消腫定痛膏原藥提取物制備：取各張氏消腫定痛膏原藥0.5 g，置15 mL離心管中，加甲醇10 mL，超聲提取1 h，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2? 測定條件

2.2.1? 液相條件? 流動(dòng)相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈;洗脫梯度：0～9 min，5%～95% B;9～10 min，95% B;10～11 min，95%～5% B;11～14 min，5% B;流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2? 質(zhì)譜條件? 電噴霧離子源（electrospray ionization， ESI）溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣（curtain gas， CUR）30 psi，碰撞誘導(dǎo)電離（collision-activated dissociation， CAD）參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿（QQQ）中，每個(gè)離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇壓（declustering potential， DP）和碰撞能（collision energy， CE）進(jìn)行掃描檢測。

2.3? 代謝物定性定量分析

（1）代謝物定性：基于MWDB數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，分析時(shí)去除了同位素信號，含K+離子、Na+離子、NH4+離子的重復(fù)信號，以及本身是其他更大分子量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號。

（2）代謝物定量：獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，用MultiaQuant軟件處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作，每個(gè)色譜峰的峰面積（Area）代表對應(yīng)物質(zhì)的相對含量，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正。

2.4? 樣本質(zhì)控分析

質(zhì)控樣本（QC）由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性。在儀器分析的過程中，每10個(gè)檢測分析樣本中插入一個(gè)質(zhì)控樣本，以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。

2.5? 數(shù)據(jù)處理

將所檢測物質(zhì)按物質(zhì)一級分類區(qū)分，得到所檢測到各類化合物總數(shù)量;將所有檢測到化合物峰面積相加定義為100%，計(jì)算單個(gè)色譜峰峰面積相對值，得該峰所對應(yīng)化合物相對含量值，根據(jù)相對含量值比較每一類化合物總含量和該類化合物分布，列出部分相對含量較高或代表性化合物信息。

3 結(jié)果

3.1? 數(shù)據(jù)質(zhì)控

利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。樣品、混樣質(zhì)控QC樣本的總離子流圖（total ions current， TIC）及MRM代謝物檢測多峰圖（多物質(zhì)提取的離子流譜圖，XIC）見圖1。通過對不同質(zhì)控QC樣本質(zhì)譜檢測分析的總離子流圖進(jìn)行重疊展示分析，可見該方法重復(fù)性及儀器穩(wěn)定性良好，為數(shù)據(jù)的可靠性提供了重要的保障。

3.2? 張氏消腫定痛膏檢測化合物分類分析

張氏消腫定痛膏中總共檢測到542種化合物，其中黃酮類化合物122種，酚酸77種，氨基酸及其衍生物42種，萜類40種，木脂素和香豆素40種，有機(jī)酸34種，生物堿33種，核苷酸及衍生物26種，脂質(zhì)25種，醌類12種，鞣酸9種，維生素8種，糖及醇類5種，其他69種。見圖2A。

各類化合物總相對含量為脂質(zhì)（24.01±4.23）%，黃酮（17.95±3.01）%，酚酸（13.37±1.79）%，木脂素和香豆素（7.38±1.27）%，氨基酸及衍生物（5.79±1.92）%，生物堿（5.49±1.73）%，有機(jī)酸占（3.96±0.78）%，核苷酸及衍生物（3.79±1.19）%，萜類（3.17±0.21）%，醌類（2.59±0.87）%，鞣酸（0.60±0.12）%，其他化合物（11.80±2.13）%。見圖2B。

將同類物質(zhì)相對百分含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中脂質(zhì)、黃酮和酚酸平均含量較高，最高含量化合物為綠原酸及其同分異構(gòu)體。見圖2C。

3.3? 張氏消腫定痛膏主要成分

將每類物質(zhì)相對含量進(jìn)行排序，部分含量較高或部分代表性化合物。見表1。

在張氏正骨膏所測得化合物中，氨基酸及其衍生物、酚酸、核苷酸及其衍生物、黃酮、木脂素和香豆素、生物堿、萜類、有機(jī)酸、脂質(zhì)、醌類和鞣質(zhì)中含量最高化合物依次為L-精氨酸、綠原酸*、2-脫氧腺苷*、鈍葉素、石防風(fēng)素、木蘭花堿、蛇藤酸、2-羥基十六烷酸、γ-亞麻酸*、大黃素和2，3-二-O-沒食子酰-D-葡萄糖，其他類化合物中狹葉墨西哥蒿素含量最高。

4 討論

通過UPLC-MS/MS和MWDB數(shù)據(jù)庫等廣泛靶向代謝組學(xué)研究平臺，在張氏消腫定痛膏中總共檢測到542種化合物，其中黃酮類化合物種類最多，為122種，黃酮具有抗炎[5]、鎮(zhèn)痛[6-7]作用;酚酸類77種，酚酸具有重要的抗炎[8]和治療神經(jīng)肌肉相關(guān)疾病[9]作用，與張氏消腫定痛膏適應(yīng)癥較一致。相對百分含量分析中最多的為脂質(zhì)，占（24.01±4.23）%，黃酮（17.95±3.01）%，酚酸（13.37±1.79）%;具體到化合物，含量超過1%的分別為綠原酸*、γ-亞麻酸*、α-亞麻酸*、亞油酸、L-精氨酸、肉豆蔻酸、狹葉墨西哥蒿素、紫檀芪等。在列表中主要化合物來源與方劑中藥材組成具有一定對應(yīng)關(guān)系，如續(xù)斷、當(dāng)歸、川芎、王不留行、紅花、羌活、威靈仙中均含綠原酸[10-17];大黃中含大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、沒食子酸等[18-19];白芷中氧化前胡素水合物、白當(dāng)歸素[20-21];紅花中羥基紅花黃色素A[22];當(dāng)歸、川芎中川芎內(nèi)酯A、川芎內(nèi)酯 I、川芎內(nèi)酯 F、川芎內(nèi)酯 H、阿魏酸[23-25];王不留行中肥皂草苷（異牡荊素-7-葡萄糖苷）、氫化阿魏酸[26-27];骨碎補(bǔ)中新北美圣草苷[28];梔子中藏紅花素1[29];劉寄奴中含異澤蘭黃素、狹葉墨西哥蒿素、異鼠李素、奇蒿黃酮等。本研究結(jié)果表明，基于UPLC-MS/MS技術(shù)對于復(fù)雜的中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有簡單、高效的特點(diǎn);但也存在一定不足，如定性分析因儀器分辨率限制或化合物性質(zhì)原因，分析準(zhǔn)確性存在一定出入，部分同分異構(gòu)體未能進(jìn)行結(jié)構(gòu)區(qū)分，后續(xù)研究中有待對主要化合物進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證;本文定量分析采用的是峰面積積分，但存在不同化合物在固定質(zhì)譜條件下響應(yīng)差異，導(dǎo)致峰面積歸一法不能較精確反映實(shí)際含量，后續(xù)需使用標(biāo)準(zhǔn)品對主要成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。該項(xiàng)目研究結(jié)果為我們篩選張氏正骨膏主要化合物進(jìn)行更深入研究提供了一定研究基礎(chǔ)。

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（本文編輯? 蘇? 維）