姚欣雨 曹振東 劉蘭祥

移植干細胞是一類具有自我更新、且具分化能力的特殊細胞，能夠通過細胞替代、營養(yǎng)作用、免疫調(diào)節(jié)等機制促進神經(jīng)系統(tǒng)的功能恢復。移植干細胞包括從骨髓或脂肪、牙髓等組織來源的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)，來源于胎兒或者成人大腦的神經(jīng)干細胞(neural stem cell，NSC)，從體外受精卵獲得的胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)，以及通過將重組基因引入體細胞獲得的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPCS)。這些不同來源、不同類型的干細胞均可以用于治療腦缺血、損傷或神經(jīng)退化性疾病[1]。

在過去的數(shù)十年，以干細胞為基礎的細胞療法治療缺血性腦卒中得到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注和研究。1988年，F(xiàn)arber等人首次提出了移植細胞可以修復缺血性腦卒中損傷的觀點[2]。2005年，Bang等人首次將自體間充質(zhì)干細胞移植到5例腦卒中患者，隨訪1年，患者功能恢復改善，實驗組巴氏指數(shù)與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義，并且一系列評估表明注射的實驗組無細胞相關(guān)不良反應[3]，基于干細胞的治療從而證實可以顯著改善缺血性腦卒中患者的神經(jīng)缺陷和日常活動[4]，為弄清干細胞在被植入腦內(nèi)后是如何發(fā)揮作用的，急需一種影像技術(shù)對其進行活體內(nèi)監(jiān)測，對其療效進行定性、定量的評估。磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI) 技術(shù)由于具有可任意平面成像的三維采集成像、極高的時間分辨力和極佳的軟組織分辨力、無電離輻射等優(yōu)點，更重要的是能提供近細胞級分辨力影像等優(yōu)勢，使其在對干細胞移植治療缺血性腦卒中的影像評價方面成為最有潛力的成像方式。

1 干細胞治療腦卒中的機制

從理論上講，缺血性腦卒中受影響的大腦可分為兩個不同的受損區(qū)域，即缺血核心區(qū)和半暗區(qū)。由于缺血核心區(qū)的血流量低于細胞存活所需的閾值，其細胞被不可逆轉(zhuǎn)地破壞、凋亡致無法挽救。相比之下，半暗區(qū)的血流量太低，無法支持神經(jīng)功能，但提供了防止細胞立即死亡所需的最低能量，如果血流量及時恢復，腦細胞仍可以恢復。因此，目前干細胞移植的治療策略包括在腦細胞死亡前挽救半暗區(qū)，或通過細胞移植[5]恢復新的神經(jīng)網(wǎng)絡。

干細胞治療對急性、亞急性和慢性缺血性腦卒中的三個階段都有效，如延長半暗期(急性期)，抑制非必要的炎癥(亞急性期)，以及啟動神經(jīng)/血管生成(慢性期)[6]。移植細胞不僅能重組神經(jīng)網(wǎng)絡，還能減少局部和全身炎癥，支持軸突再生和突觸萌發(fā)，減少膠質(zhì)瘢痕的形成。這些作用主要通過兩種機制來實現(xiàn)：①細胞分化(細胞替代)。細胞替代可以通過將移植細胞分化為神經(jīng)元細胞或血管細胞等來彌補失去的功能，也可以通過神經(jīng)元祖細胞的直接定居和發(fā)育來實現(xiàn)[7-8]。②旁分泌因子(旁觀者效應)。細胞分泌各種營養(yǎng)因子，如細胞因子、趨化因子和外泌體，可以改善神經(jīng)損傷或再生新的神經(jīng)回路[9-10]。除了促進抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用外，這些因素還誘導抗凋亡作用，并調(diào)動內(nèi)源性干細胞/神經(jīng)祖細胞[11]。這些因子通過直接滲透或細胞外囊泡釋放到周圍環(huán)境中，并通過脾臟和胸腺等外周免疫器官直接改善缺血損傷，下調(diào)局部和全身炎癥[12-13]。近來又有研究報告提出，恢復半球間雙側(cè)運動皮層連接可能是干細胞促進神經(jīng)功能恢復的另一種機制[14]。

2 MRI對評價移植干細胞效果的應用

MRI可在干細胞移植時確認靶點，有效對移植入腦內(nèi)的干細胞進行跟蹤監(jiān)測、顯示其遷移，對腦組織在干細胞植入后出現(xiàn)的一系列組織形態(tài)學上的變化進行追蹤，結(jié)合圖像分析技術(shù)可以對腦組織形態(tài)進行更好的觀察，一些特殊序列可對腦組織的血流灌注和代謝情況進行顯示，從而評估干細胞對缺血性腦卒中的治療療效。

2.1 常規(guī)MRI對于局部腦組織變化的觀測 眾所周知，MRI是診斷缺血性腦卒中最有效的影像技術(shù)[15]，在CT出現(xiàn)可識別的低密度區(qū)之前，MRI常規(guī)掃描的彌散加權(quán)成像 (diffusion weighted imaging，DWI)序列以及據(jù)其計算出的表觀彌散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC) 即可觀察到明顯的異常改變，精確定位缺血損傷區(qū)域以及其受累范圍[16]。MRI可以在干細胞移植后對干細胞遷移、歸巢等生物學行為進行觀察，還可以同時對缺血損傷區(qū)的改變提供更多影像方面的信息，例如可對缺血損傷區(qū)域的大小和信號變化進行較直接的觀察，還可通過對MRI圖像進行不同的后處理、分析，對干細胞造成局部組織的變化可以更精準的觀測與判斷。

除了對缺血性腦卒中病灶的精確顯示，MRI還可以在干細胞移植入腦內(nèi)之后對其進行示蹤的同時，通過圖像分析可對缺血損傷區(qū)的范圍、信號等變化程度進行高靈敏度的觀測，從而對干細胞引起腦組織的變化進行有效的觀察。由于常規(guī)MRI圖像分析簡便易行，不需要復雜的處理及運算，不僅可以在干細胞移植后不同時間點多次重復測量，還可以提供全腦整體的影像，從而發(fā)現(xiàn)一些可能引起遠隔部位原發(fā)缺血損傷部位的異常改變，為干細胞治療缺血性腦卒中機制的研究提供理論依據(jù)。

McGarry等人[17]的一篇實驗報告指出，在常規(guī)MRI序列中，在相同的腦血流閾值下，腦缺血開始后數(shù)分鐘內(nèi)，DWI信號升高，ADC值急劇下降，而T2弛豫時間對腦卒中缺血受損的組織信號變化具有時間敏感度。

彌散張量成像(diffusion tensor imaging，DTI)是在DWI上發(fā)展出來的新型技術(shù)，其衍生的錐體束完整性的分數(shù)各向異性(fractional anisotropy，F(xiàn)A)測量最近被證明可以預測剩余的神經(jīng)運動功能，即神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，預期可以通過治療恢復達到的功能水平。然而，Yassi N等人指出[18]，這種測量的預測能力往往局限于特定的神經(jīng)解剖部位，因此大大減少了其可靠預測的范圍。

Spellicy SE等人通過探討神經(jīng)干細胞外囊泡對缺血性腦卒中的療效[19]進行了一系列的參數(shù)研究，通過在MRI上的軸位、冠狀位對中線的移位程度進行測量，提示：中線移位(MLS)程度與所記錄的實驗對象步態(tài)和行為等參數(shù)具有最高的顯著相關(guān)性，支持將中線移位作為一種可靠、有效、轉(zhuǎn)化和預測功能恢復的指標，認為該指標可以通過與已建立的功能相關(guān)性的差異來評估干細胞治療的臨床療效。

最近Leftin A等人的一項研究提出[20]，在高場強下，不同的MRI圖像參數(shù)的縱向行為及對于干細胞治療后缺血性腦卒中恢復效果的診斷存在差異，根據(jù)ADC所反映的水腫和腫脹恢復的時間，能夠提供較為準確的信息，表明ADC對缺血的恢復反映最為靈敏。

2.2 常規(guī)MRI對移植干細胞的監(jiān)測 為了明確干細胞移植入腦內(nèi)后的一系列生物學行為，很重要的一項任務是需要對其進行監(jiān)測。對外源性移植干細胞的監(jiān)測傳統(tǒng)的方法依賴于組織病理學，這種方法具有侵襲性，需要進行制備切片和觀察免疫組化染色結(jié)果。在動物實驗研究中需要處死動物還不足以揭示移植細胞在宿主活體組織中的遷移和命運，因此，存在著很大的限制。在臨床上我們需要一種非侵入性的方法，可以提供注射后細胞的功能、生存能力和運輸數(shù)據(jù)[21]，為滿足這種需求，分子影像技術(shù)被提出并得到進一步發(fā)展。MRI由于具有高空間分辨率的特性，使得它成為活體內(nèi)監(jiān)測移植干細胞最有效的方式。

最近許多研究聚焦于探索移植干細胞更好的追蹤效果。如2019年，胡越等人[22]利用生物發(fā)光成像(bioluminescence，BLI)與MRI相互結(jié)合的方式追蹤移植入大鼠肝臟內(nèi)的間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)在移植術(shù)后，移植區(qū)域的生物發(fā)光信號顯著增強，然后隨時間逐漸下降，MR信號也隨之下降，由此證明了二者對于活體內(nèi)移植干細胞示蹤的確定意義。2020年杜磊等人[23]的一項實驗開發(fā)用聚乙二醇/聚乙烯亞胺修飾SPIO標記的移植脂肪源性干細胞治療阿爾茨海默病MRI活體示蹤的可行性，標記的細胞可以在MRI上清晰地觀測到呈低信號，而標記組與非標記組的水迷宮逃避潛伏時間無統(tǒng)計學差異，也證明了其安全性。

另有一項Piotr Walczak等人的研究[24]表明，基于GE-EPI脈沖序列的高速MRI也可用于實時監(jiān)測經(jīng)動脈輸注到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞。MRI引導不僅可以很好地提高動脈灌注基礎的血腦屏障開放和化療藥物給藥的精確性，還能夠預測干細胞的歸宿、驗證經(jīng)動脈細胞輸注后血管的通暢性，此種方式還允許將干細胞經(jīng)動脈高度精確的灌注到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這種方法對于干細胞灌注的實時成像至關(guān)重要。該項研究展示了這項技術(shù)在大型動物的可行性，也證明了臨床的可譯性。

2.3 MRI圖像分析技術(shù)的應用 MRI常規(guī)序列能夠提供的信息相對有限，而通過一些圖像分析技術(shù)對常規(guī)MRI所得圖像進一步的分析，可以獲得更多的信息。2017年，Rui He等人提出一種基于MRI的圖像分析技術(shù)[25]——參數(shù)響應圖(parametric response map，PRM)，這是一種基于體素的分析技術(shù)，在多參數(shù)MRI圖中應用。這種技術(shù)已用于分析包括膠質(zhì)瘤和原發(fā)性腦出血在內(nèi)的多種腦疾病。PRM是一種很有前途的工具，可以在體素水平上研究異質(zhì)性病變(如缺血性腦卒中等疾病)隨時間的參數(shù)變化，用來評估治療效果。治療1 d后，PRM分析即能夠判斷出MSCs誘導的細胞水腫、微血管可塑性和血管擴張的變化。而經(jīng)典的全損傷方法無法評估這些早期治療效果。PRM方法也能顯示病變內(nèi)不同位置、不同時間點發(fā)生的改變。因此，這種算法能夠較為靈敏地評價干細胞植入腦內(nèi)后造成的局部組織變化程度。

2019 年，Guangming Zhu 等 人 使 用 一 種 基 于DWI MRI的血管內(nèi)非相干運動(intravoxel incoherent motion，IVIM)，通過多b值序列測量微血管灌注[26]，IVIM可以類似于MR灌注成像來評價缺血性腦卒中，首先需要通過DWI來確定缺血核心，繼而通過IVIM f或IVIM fD*來勾畫出半暗帶。2020年，Asit Subudhi等人[27]提出了一種基于計算機輔助決策系統(tǒng)、以及MR圖像序列彌散加權(quán)圖像(DWI)的缺血性腦卒中自動檢測方法，利用期望最大化算法對腦卒中影響區(qū)域進行分割，并利用分數(shù)階達爾文粒子群算法對分割區(qū)域進行進一步處理，以提高檢測精度。這種計算方法可以精確地對缺血受累區(qū)域劃分，在報告的192次MRI掃描中準確率達到93.4%，為干細胞的治療提供決策，也可以對治療后的腦組織缺血損傷程度及代謝情況進行判斷。

最近，Richard E等人提出一種臨床可翻譯MRI算法[28]——分級區(qū)域分割算法，這種算法提供了一種嚴格、快速、前瞻性、非侵入性的方法，用于識別具有對NSCs神經(jīng)保護作用機制有反應的損傷部分。植入的NSCs只有在存在核磁共振可測量的半暗帶時才能改善受損、運動和/或認知結(jié)果，從而阻止其演變?yōu)閴乃赖暮诵?；而缺血核心的損壞是不可逆的，無法得到改善。因為與缺血核心不同，半暗帶的分子結(jié)構(gòu)是可以搶救的。這種算法也提示，只有半暗帶核心的損傷區(qū)域才有使用細胞治療的意義，這樣的測量方法也引起了再生醫(yī)學領域的一些討論。

2.4 MRI的特殊序列的應用 干細胞移植作為一種治療缺血性腦卒中有前途的細胞療法，其臨床療效作用的評價十分重要，除了必要的神經(jīng)功能評分等臨床評價，影像評估能更加為干細胞及其對腦組織的影響提供信息，從而對療效進行判斷。除了常規(guī)MRI的T1、T2、DWI等序列對于干細胞移植治療缺血性腦卒中影像的評價，一些基于MRI的特殊序列也不同程度地、直接或間接地反映了移植干細胞及腦組織的變化。

例如，磁敏感加權(quán)成像(susceptibility weighted imaging，SWI) 序列可以對磁性粒子標記干細胞連續(xù)、無創(chuàng)地追蹤和顯示，還可以敏感地顯示微出血、間接顯示干細胞的遷移路徑；灌注成像序列(perfusion weighted imaging，PWI) 可以顯示腦組織的血流灌注情況，精確地反映干細胞植入前、后腦組織的實時存活情況。趙琪等人在一篇實驗報告中指出，灌注加權(quán)成像序列對于急性缺血性腦卒中預后有著很高的診斷價值[29]，灌注成像的腦血流流量界值為5.90 mL/(100 g·min)時，預測預后良好的敏感度為73.3%，特異度為87.5%；當ADC界值為0.42×10-3mm2/s時，預測預后良好的敏感度為74.3%，特異度75.0%；波譜分析成像(magnetic resonance spectrum，MRS)序列可顯示損傷灶及周圍腦組織的代謝，從而反應其活力，例如張冰等人[30]發(fā)現(xiàn)，在腦卒中后的3 h即可測到升高的乳酸峰。2020年，Ahmed A Khalil等人發(fā)現(xiàn)血氧水平依賴性(BOLD)信號振蕩的相對延遲可以在MRI不使用造影劑的情況下評估腦灌注的變化[31]，從而成為對腦卒中細胞療法療效的評價方式。

2.5 使用磁性納米顆粒對干細胞進行標記 使用超順磁性化鐵顆粒 (super paramagnetic iron oxide，SPIO)對干細胞進行標記，是常規(guī)MRI監(jiān)測移植干細胞最廣泛使用的方法。SPIO是MRI在干細胞標記監(jiān)測中的首選材料，并且在國內(nèi)外已經(jīng)被廣泛地研究。SPIO對細胞進行標記不會影響其增生、分化能力，這一點在國內(nèi)外諸多實驗中已經(jīng)得到了證實。SPIO可以在生物體內(nèi)通過鐵代謝途徑安全降解，一些SPIO早在近20年前就已經(jīng)被美國FDA批準用于人體[32]。標記的方式有兩種，即：①將氧化鐵顆粒直接注入大腦或腦室，原位標記增生的干細胞。②用氧化鐵顆粒在體外標記細胞，然后移植到大腦或血管系統(tǒng)內(nèi)[33]。MRI常規(guī)平掃的所有序列均可顯示局部移植的標記干細胞，而梯度回波序列最為敏感，SPIO標記的干細胞由于其順磁性而呈低信號。腦的局部缺血、損傷等局部微環(huán)境可以通過趨化作用使植入干細胞按時間順序遷移至損傷區(qū)域，這一點可以通過對SPIO標記的NSC進行的T2*加權(quán)MRI掃描清晰地被觀測到，如2019年Jiang Lili等人[34]所發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移，注射點代表植入干細胞的低信號向損傷區(qū)域遷移，這與緊接著進行的H-E染色、普魯士藍染色顯示的細胞分布結(jié)果一致。2020年，Guangtian Wang等人的一項研究[35]發(fā)現(xiàn)移植干細胞通過胼胝體定向歸巢到缺血損傷組織，利用熒光成像進行體內(nèi)追蹤，熒光信號呈進行性下降，在移植3周內(nèi)由100%下降至25%，表明移植的干細胞逐漸遷移到梗死側(cè)，該研究結(jié)果也與之前Jiang Lili等人研究所述結(jié)果一致[34]。

3 其他成像方式的應用

除了MRI以外，還有一些分子成像技術(shù)可以應用于追蹤移植干細胞及對其療效進行影像評價，例如基于同位素示蹤原理顯像的單光子計算機斷層成像(SPECT)、正電子發(fā)射斷層顯像(PET)，以及利用熒光物質(zhì)、熒光蛋白或者熒光素酶等進行標記從而顯像的光成像技術(shù)等，均可以對標記的移植干細胞進行追蹤，這些成像方式與MRI相比，檢測的靈敏度均較MRI高，但是檢測的分辨率遠不及MRI。這些成像方式對于腦組織的形態(tài)學，代謝情況改變也可以提供不同程度的信息。

4 MRI應用于干細胞療效評價的局限性

MRI在這方面也存在著一些局限性，例如基于直接細胞標記的細胞MRI非常適合于實時、磁共振引導的干細胞輸送以及細胞移植的即時監(jiān)測，SPIO標記干細胞在MRI上呈現(xiàn)的低信號體積的動態(tài)變化可以反映細胞存活和凋亡的趨勢，但可能由于移植細胞周圍存在含鐵巨噬細胞而高估了細胞的長期存活從而造成假陽性，影響結(jié)果的精確度[36]。其次，MRI成像十分依賴于設備和各項參數(shù)，如果條件受到限制而無法達到最佳配置，將會對結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。除此之外，成像速度也會受到一定程度的限制。

5 未來的發(fā)展趨勢與展望

按照目前的研究形勢來看，干細胞移植進入腦內(nèi)后的生物學行為尚未完全清晰，通過多種機制而造成的腦組織改變也尚無較為統(tǒng)一的標準。許多研究致力于尋找在體內(nèi)追蹤標記干細胞更有效的方式，包括基因轉(zhuǎn)導細胞、分子探針的開發(fā)應用、合適的顆粒涂層等，而更具有臨床應用性、關(guān)注腦組織細微的形態(tài)學和代謝改變者相對較少。因此，在對干細胞進行示蹤的同時，以精確、靈敏顯示腦組織變化的研究將會得到開展。在這種需求下，為了對干細胞療效進行更充分的評價，在未來多種成像方式相互結(jié)合、互相取長補短的多模態(tài)成像將是必然的發(fā)展趨勢。