李庭浩 童行 何衛(wèi)陽

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其在全球的癌癥發(fā)病率中排名第十，也是我國泌尿外科最常見的惡性腫瘤之一[1-3]。依據(jù)其病理進展分為肌層浸潤性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, MIBC)和非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)。研究表明應用新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy, NAC)對MIBC患者進行聯(lián)合治療能夠一定程度實現(xiàn)腫瘤降級或改善預后[4-6]，但由于治療費用較高、患者耐受性差及應答率低等原因，在實際應用中存在著一定的局限性[7]。因此探尋MIBC進展機制，延緩或減少其轉移復發(fā)，從而提高患者術后生存質量顯得十分重要。自噬及糖代謝重編程在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，膀胱癌作為實體瘤的一種，其癌細胞處于癌組織、正常組織及細胞間質、微血管等形成的腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)中，多處于炎癥、缺氧或饑餓狀態(tài)，并且在放化療等進一步刺激下，內(nèi)環(huán)境的變化可能導致癌細胞代謝壓力增大，此時癌細胞可能通過自噬協(xié)助應對[8]，同時癌細胞因此發(fā)生細胞形態(tài)、細胞代謝狀態(tài)和生物行為的改變，部分細胞甚至轉變?yōu)樵鲋衬芰υ鰪?、侵襲轉移能力增加、耐藥能力上升和腫瘤免疫逃避等腫瘤進展性變化[9-10]。癌細胞特征性改變之一是糖代謝的重編程，這可能也是由于TME刺激引起，在營養(yǎng)缺乏的情況下通過改變糖代謝方式并減少耗氧量使細胞向著更利于生存的方向轉變，進而促進癌癥的進展性發(fā)展[11]。諸多研究發(fā)現(xiàn)自噬或糖代謝重編程在膀胱癌惡性進展中扮演著十分重要的角色，但多作為獨立影響因素來進行探究，而在其他實體瘤諸如肝癌、膠質瘤中發(fā)現(xiàn)二者可能存在著相互影響，共同發(fā)揮影響腫瘤進展的作用，但目前在膀胱癌中報道尚少。故本文擬對近期膀胱癌關于自噬和糖代謝兩方面的研究進展進行綜述，并總結二者在已有研究中存在的關系和對腫瘤的影響，嘗試從新的角度闡述影響膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的機制，為治療MIBC提供可能的研究方向。

一、糖代謝重編程在膀胱癌中的研究進展

1.糖代謝重編程與癌癥：癌癥的一種重要特征是能量代謝的改變，以利于其增殖及侵襲轉移等能力的形成[12]。葡萄糖作為細胞主要的供能物質，正常狀態(tài)下會被細胞攝取后通過有氧代謝途徑最終在線粒體產(chǎn)生大量的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)用于供能，然而實體瘤細胞因其不僅有快速增殖的特性，而且往往處于低氧、饑餓等TME中，使其需要一種能夠更快速的代謝糖以產(chǎn)生所需的能量和原料的方式，即糖的有氧糖酵解[13-14]。腫瘤細胞內(nèi)糖的有氧糖酵解轉變最早是由Warburg提出的[15]，也稱為瓦伯格效應，指癌細胞即使是在氧氣充足的狀態(tài)下依舊通過高速糖酵解快速產(chǎn)生ATP，并且不再偶聯(lián)線粒體氧化代謝，產(chǎn)生的丙酮酸大多數(shù)由乳酸脫氫酶催化而在細胞質基質中轉化為乳酸[16]。起初Warburg認為有氧糖酵解的出現(xiàn)是因為線粒體受損，但后來的研究發(fā)現(xiàn)在線粒體完好的情況下癌細胞依然表現(xiàn)出瓦伯格效應，而糖代謝的重編程與線粒體DNA、致癌基因和腫瘤抑制因子等的改變密切相關[17]，因此有理由懷疑腫瘤細胞的糖代謝重編程可能參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程。近年來不斷有研究者發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者的癌細胞中存在著異常的糖代謝重編程，其代謝方式的改變可能在膀胱癌進展性生長中起到了關鍵的作用。

2.糖代謝重編程參與膀胱癌耐藥形成：膀胱癌的癌細胞糖酵解異常增加主要歸因于糖酵解相關基因的過表達以及糖酵解關鍵酶的產(chǎn)生或功能異常[18]，這可能促進了癌細胞耐藥性的增強。丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase, PDK)家族可調(diào)控丙酮酸脫氫酶活性，其可通過將丙酮酸的代謝從線粒體內(nèi)轉移至胞漿中，促進有氧糖酵解的形成。在其它腫瘤中已有研究證實抑制PDK能有效逆轉腫瘤細胞對化療藥物的耐藥[19]，Woolbright等[20]研究發(fā)現(xiàn)高度惡性的膀胱癌細胞PDK4表達明顯增高，利用PDK4競爭性抑制劑DCA以及siRNA敲低相關基因表達后，腫瘤細胞會在G0～G1期被抑制生長，同時聯(lián)合膀胱癌化療藥物順鉑可有效的增加藥物對腫瘤細胞的殺傷能力。該文作者認為PDK4是通過增強有氧糖酵解，使ATP快速生成能力提高以及對順鉑作用的線粒體去極化誘導凋亡的抵抗，進而產(chǎn)生對化療藥物的耐藥能力形成[21]。另外M型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M, PKM)作為丙酮酸激酶的一種亞型，調(diào)節(jié)磷酸烯醇丙酮酸向丙酮酸的轉化，也是糖酵解的限速酶之一[21]。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)相較于正常膀胱組織，無論是低級別的NMIBC還是高級別的MIBC，PKM2亞型的表達均遠高于PKM1，而降低其異常表達可有效阻遏癌細胞的增殖以及耐藥能力，增加順鉑對腫瘤細胞的殺傷作用；并且在對三株膀胱癌細胞進行耐藥誘導的實驗中發(fā)現(xiàn),隨著順鉑濃度不斷增加，細胞的耐藥能力與檢測到的PKM2表達量呈正相關。盡管越來越多的證據(jù)顯示瓦伯格效應與膀胱癌的耐藥能力形成有關，但具體機制仍不清楚，可能與葡萄糖的攝入增加和代謝異常相關，也可能是影響了腫瘤細胞其他代謝方式包括脂代謝以及氨基酸合成等，而無論是膀胱癌還是其他癌癥中均有實驗均已證實抑制癌細胞糖代謝的重編程可以有效地逆轉癌癥的耐藥，增加藥物對腫瘤的殺傷作用[23-24]。就目前的研究表明，膀胱癌細胞通過改變其糖酵解關鍵酶的表達水平，利用線粒體代謝改變等方式影響其程序性凋亡，進而產(chǎn)生耐藥性是較為主流的研究方向，然而關鍵酶表達或轉錄后修飾的原因，可能是通過轉錄因子或修飾酶的增減，抑或是DNA本身的變化導致，都值得進一步研究。

3.糖代謝重編程與膀胱癌惡性程度的相關性：惡性程度較高的癌細胞株也顯示了更高的糖酵解轉變。研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，盡管在氧氣充足的環(huán)境下體外培養(yǎng)，非侵襲性的乳腺癌細胞株相比侵襲性的株系糖消耗量更少,這說明惡性程度更高的腫瘤細胞糖酵解的代謝轉變可能更多[13]，類似的實驗在膀胱癌中同樣被證實并得到了進一步的探究。Conde等[25]分別對MIBC細胞株TCCSUP和NMIBC細胞株RT4進行了代謝攝取與消耗，在相關蛋白表達量的對比中發(fā)現(xiàn)，盡管葡萄糖轉運蛋白3(GLUT3)和糖消耗量在兩個細胞株系中無明顯差別，相對惡性程度更高的TCCSUP細胞GLUT1和PFK蛋白的表達有著明顯的上升，而且丙酮酸的消耗量及乳酸與丙氨酸的生成量也要高于RT4細胞。而這些變化是如何產(chǎn)生的，以及其對膀胱癌細胞侵襲和轉移的影響是如何作用的，可能還需要進一步的探究。

綜上，盡管瓦伯格效應對癌癥的影響距離被提出已經(jīng)將近百年，對它的研究也從未停止，然而線粒體功能的下降或抑制與糖酵解的代謝重編程過程的機制始終未得到充分的認識。隨著葡萄糖類似物示蹤技術即氟脫氧葡萄糖-正電子體層掃描的應用，且在應用中進一步證實了在惡性程度越高的腫瘤患者中，原發(fā)灶和轉移灶都顯示了更高的葡萄糖攝取率，對糖代謝重編程在癌癥中的探索仍然具有重要的意義。膀胱癌細胞特別是在惡性程度較高的癌細胞中有氧糖酵解程度更高，提示其可能影響了膀胱癌在侵襲、增殖或耐藥能力形成等進展性變化過程，對其代謝轉變的上游機制進行探究并進行阻斷，能夠在一定程度上阻遏其惡行進展過程，為膀胱癌甚至泛癌治療提供新手段。

二、自噬在膀胱癌中的研究進展

1.自噬與癌癥：自噬是真核細胞進化出的一種保守的生理分解代謝過程，于1966年首次由De Duve等[26]提出，在體細胞中以基礎水平保持[3]。細胞自噬可按照物質運送至溶酶體方式的不同分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬，其中巨自噬作為研究的熱點[27]，其作用相對更加重要，本文主要以巨自噬作為自噬的主要形式進行討論。自噬在癌細胞的發(fā)生、發(fā)展中扮演著雙刃劍的角色，當處于應激狀態(tài)下如缺氧、饑餓、照射或化療時，細胞可通過上調(diào)細胞自噬水平，將老化的細胞器或蛋白進行包裹形成自噬小泡，再同溶酶體相結合形成自噬-溶酶體復合物并進一步進行降解，從而阻止損傷的蛋白和細胞器的積累，以保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，起到抗腫瘤的作用；但同時分解的產(chǎn)物同樣可暫時的供應細胞能量，幫助應對刺激維持細胞的生存[28-29]。自從自噬這種生物學過程被提出以來，越來越多的實驗證實了自噬在膀胱癌晚期的進展中可能起到了促進的作用，在膀胱癌侵襲能力的增加和耐藥的形成過程中可能引起了關鍵的變化。

2.自噬相關基因(autophagy related gene, ATG)與膀胱癌惡性進展：ATG的上調(diào)可能是膀胱癌進展性變化的重要一環(huán)。ATG家族編碼的一系列蛋白參與了自噬相關的諸多過程，其中ATG7作為必需的自噬基因，編碼泛素樣蛋白LC3家族脂化和自噬小體形成所需的E1酶，在諸多研究中得以探究[30]。Zhu等[31]對包括侵襲性膀胱癌細胞、臨床膀胱癌組織及裸鼠異體腫瘤組織與正常尿路上皮細胞進行對比后發(fā)現(xiàn)，ATG7的異常高表達與腫瘤侵襲能力增加顯著相關，并進一步對其機制進行探索。他們對ATG7 mRNA的3’端可結合miRNA進行篩選后發(fā)現(xiàn)，miR190A可通過直接結合ATG7 mRNA的3′端非編碼區(qū)來增加ATG7 mRNA的穩(wěn)定性，進而引起ATG7的蛋白表達量上升和自噬水平的增強。進一步探究后發(fā)現(xiàn)ATG7可能通過提高自噬水平進而提高膀胱癌侵襲的能力，其機制是ATG7過表達使HNRNPD蛋白在膀胱癌細胞中自噬消化增多，RNA結合蛋白免疫實驗證實了HNRNPD蛋白可結合ARHGDIA mRNA使其翻譯受損，HNRNPD蛋白的降解增多使ARHGDIA mRNA穩(wěn)定性得到了增加，從而使ATG7下游的ARHGDIA過表達，引起膀胱癌細胞的侵襲性增加。這篇報道結合體內(nèi)和體外實驗證實了MIBC侵襲能力的增加是ATG7提高細胞自噬水平引起的下游事件，證明了自噬促進了膀胱癌的進展。Wu等[32]通過對膀胱癌患者癌及癌旁組織對比發(fā)現(xiàn)了長鏈非編碼RNA尿路上皮癌胚抗原1(lncRNA UCA1)的高表達，lncRNA UCA1可通過結合miR-582-5p來阻止其與ATG7的結合，使ATG7表達量升高、自噬水平上調(diào)，而通過shRNA敲低lncRNA UCA1可有效的抑制膀胱癌細胞的自噬，從而抑制癌細胞的增殖、侵襲及耐藥能力。不僅ATG7，ATG家族其他成員與膀胱癌的惡性進展均有著密不可分的影響關系，大多數(shù)研究表明自噬相關基因與其他調(diào)控因子的協(xié)同改變可能促進癌細胞的進展，相關蛋白的調(diào)控如lncRNA或microRNA作為ceRNA影響蛋白的功能或蛋白修飾的改變，可能在癌癥進展中起到了重要的作用。

3.自噬與膀胱癌耐藥形成：自噬可作為癌細胞一種保護性的反應，在應對藥物時通過上調(diào)自噬來抵抗藥物引起的凋亡以逃避殺傷作用，誘導癌細胞獲得性耐藥。研究表明MIBC患者特別是T2級別及以上患者接受NAC可有效使腫瘤降級，利于患者的手術及預后[33]，NAC的常用方案是基于鉑類藥物為主，如最早的MAVC(甲氨喋呤+長春新堿+阿霉素+順鉑)方案，目前較多使用的GC(吉西他濱+順鉑)方案以及針對藥物不耐受所提出的以卡鉑替代順鉑的GCarbo方案[34]。然而仍有一相當部分患者對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，這不僅使患者無法從中獲益，延遲治療時機，還給患者帶來藥物不良反應的傷害[34]?；熌退帣C制復雜，自噬可能參與其形成過程。Lin等[35]對高級別膀胱癌細胞對順鉑的藥物敏感性進行了探究，發(fā)現(xiàn)順鉑會引起膀胱癌細胞BECN1基因的過表達，通過影響ATG7/12進而引起自噬的水平升高，自噬在一定程度上減輕或阻止順鉑誘導的膀胱癌細胞凋亡。而應用自噬抑制劑氯喹或Baf A1以及應用shRNA敲低BECN1阻斷自噬后細胞凋亡增加，提示了自噬可能參與順鉑的耐藥形成過程。Jiménez-Guerrero等[36]就抗血管生成藥物紫杉醇在尿路上皮癌耐藥的探究中發(fā)現(xiàn)，Mcl-1抑制劑與紫杉醇聯(lián)用后可誘導原本對紫杉醇耐藥的膀胱癌細胞發(fā)生凋亡，其機制可能是抑制劑通過增加Beclin1的分解抑制耐藥細胞的自噬，以及抑制Mcl-1使其泛素化從而阻滯S/G2期的細胞逃避有絲分裂滑脫，幫助克服耐藥細胞對紫杉醇的抵抗。

綜上，在膀胱癌的晚期進展過程中尤其是在其轉移以及耐藥的形成上，自噬可能作為一種細胞反應性的機制，通過不同的信號途徑在細胞周期調(diào)控或代謝調(diào)節(jié)的過程中影響癌細胞的進展。而在針對線粒體的化療過程中，異常的自噬水平可能作為一種代謝的適應性改變，從而導致癌細胞產(chǎn)生耐藥性，促進了膀胱癌的惡性轉化[37-38]。

三、自噬調(diào)控糖酵解在癌癥進展中發(fā)揮的作用

1.自噬調(diào)控代謝重編程在癌癥進展中的作用：在癌癥進展的過程中，異常的增殖能力與TME營養(yǎng)物質缺乏、惡劣微環(huán)境似乎是矛盾的，但二者確實同時存在。其可能的解釋是通過增加代謝產(chǎn)物的重利用，以及通過降解與生長無關的物質或受損細胞器，并改變細胞的代謝方式和結構，最大限度地供給癌細胞的生長與進展的相關物質合成[39]。理論上代謝重編程與自噬可以相互作用以供給細胞所需的大多數(shù)營養(yǎng)物質，自噬在癌細胞的代謝重塑中扮演著重要的角色，相關聯(lián)的核心為三羧酸循環(huán)。諸多實驗對癌細胞代謝重編程進行探究，包括糖代謝、脂代謝以及氨基酸代謝等，均發(fā)現(xiàn)與癌癥的進展有密切的關系，而自噬在其中起到關鍵的作用[40-41]。Strochecker等[42]研究發(fā)現(xiàn)敲低自噬相關基因ATG7可通過阻斷自噬影響肺癌細胞的氧消耗率及癌細胞生長，而在敲低的細胞中加入外源性谷氨酰胺能夠使細胞的增殖能力得以恢復，故認為肺癌細胞通過自噬影響谷氨酰胺代謝的重編程，進而影響癌細胞的進展性生長。Ma等[43]在膽管癌細胞中發(fā)現(xiàn)異常高表達的lncRNA HAGLROS與癌癥的生長及惡性進展呈明顯相關性，敲除lncRNA HAGLROS后，可抑制mTOR通路促進自噬進而改善癌細胞脂質代謝重編程，從而阻斷癌細胞的惡性進程。因此自噬在調(diào)節(jié)癌細胞代謝重編程過程中可能扮演著上游開關的角色，進而影響著癌細胞生物學行為的改變。

2.自噬調(diào)控糖代謝重編程在膀胱癌及其他癌癥中的研究：癌細胞特征性表現(xiàn)之一為葡萄糖代謝由氧化磷酸化向糖酵解轉變，這一現(xiàn)象也被稱為瓦伯格效應，自噬在其中的影響以及對癌細胞惡性進展等方面有著較為成熟的研究。TME在其中扮演著多重角色，當細胞處于營養(yǎng)充足的環(huán)境中時，雷帕霉素復合物1(MTORC1)可促進細胞生長，并通過抑制ULK1抑制自噬，而當細胞供能不足時AMPK將被活化，并通過抑制MTORC1而激活ULK1調(diào)控自噬的發(fā)生，提示細胞的糖代謝與自噬有著相互影響的作用[44]。另有研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞中miRNA-21可以經(jīng)PTEN/PI3K/AKT/mTOR信號通路提高癌細胞有氧糖酵解，針對該靶點的慢病毒可有效阻遏該效應[45]。lncRNA UCA1是膀胱癌中最早發(fā)現(xiàn)過表達的lncRNA之一[46]，Li等[47]發(fā)現(xiàn)lncRNA UCA1能夠上調(diào)糖酵解關鍵酶己糖激酶2(hexokinase, HK2)活性從而引發(fā)細胞的瓦伯格效應，其具體機制為lncRNA UCA1通過mTOR活化了STAT3并抑制miRNA-143。盡管在膀胱癌中研究較少，但HK2的活性調(diào)節(jié)在肝癌中起到了自噬調(diào)控糖酵解的開關作用，在肝癌細胞中由泛素連接酶TRAF6催化Lys63使HK2泛素化，自噬可以依靠SQSTM1/p62受體識別并選擇性降解泛素化HK2，從而抑制肝癌細胞有氧糖酵解和肝癌細胞增殖[48]。此外，單羧酸轉運蛋白作為轉運乳酸以及清除氫離子的重要蛋白，在調(diào)控癌癥代謝與自噬間同樣起著重要的作用[49]。在膀胱癌患者中MCT1過表達與患者癌癥進展及預后顯著相關，敲低后可明顯降低糖酵解途徑關鍵酶活性、減少乳酸生成并延緩膀胱癌細胞增殖、侵襲、轉移及上皮間質轉化等惡性進展，證實膀胱癌細胞的瓦伯格效應變化與惡性進展呈正相關[50]。饑餓誘導肝癌細胞自噬水平的增強，可通過Wnt/β-catenin信號通路正向調(diào)節(jié)MCT1的過表達，促進癌細胞有氧糖酵解的發(fā)生以及侵襲能力增強[51]。此外在急性髓系白血病中敲低lncRNA HOTAIRM1也可通過Wnt/β-catenin途徑有效地抑制P型磷酸果糖激酶(PFKP)的活性，抑制癌細胞的糖酵解并逆轉其介導對阿糖胞苷的耐藥作用，而沉默PFKP能夠有效抑制饑餓誘導的自噬水平上調(diào)所引起的癌細胞有氧糖酵解增加以及上皮間質化轉變[52-53]。由此可見自噬的異常激活可能從正反兩個方向調(diào)控著糖代謝的重編程，進而扮演著抑癌或促癌的雙重角色，兩者錯綜復雜的調(diào)控關系改變可能與其上游啟動的不同機制密切相關，不同激活途徑誘導的不同結局對癌癥進展的認識和治療有著重大的意義。

在實體瘤所處的TME中，正常代謝受到限制的腫瘤細胞可以依靠自噬生存，并重新編程其代謝以適應細胞的快速生長和增殖[8]。盡管目前對于不同信號通路在癌細胞自噬與糖酵解重編程之間所起到的橋梁連接作用已有較多研究成果，且逐漸認識到癌細胞的自噬及代謝重編程等變化與癌癥進展性生長以及侵襲轉移、耐藥形成甚至是免疫逃避等有著密不可分的關系，但其機制更多傾向于自噬相關基因與糖酵解關鍵酶所受的相互調(diào)控，其中復雜的啟動及調(diào)控網(wǎng)絡都值得探索。目前對于自噬及瓦伯格效應在膀胱癌中的相互作用關系尚未見報道，對其更加深入的研究可能從新的視角更好認識這一疾病，為探索膀胱癌發(fā)展機制以及延緩其進展的治療策略奠定基礎。

近年來，針對探索膀胱癌特別是高級別惡性膀胱癌行之有效的治療手段一直是研究探索的熱點，放療、NAC以及免疫治療等研究均獲得了一定的成效，尤其是針對轉移性膀胱癌的免疫檢查點PD-1和PD-L1的單克隆免疫抗體阻斷治療取得了較好療效[54-55]。膀胱癌細胞異常上調(diào)的自噬以及有氧糖酵解的代謝重編程均被發(fā)現(xiàn)與癌癥的惡性進展密切相關，自噬對糖酵解以及關鍵酶轉錄或表達層面的影響均被證實為可能是影響癌癥發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，對二者的聯(lián)合抑制也可能成為新的更安全有效的治療策略，而二者由何啟動及調(diào)控，與其對膀胱癌進展影響的作用也值得進一步的探究。