李夏林 劉赫 易偉宏

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性病變，通常是由于肥胖、勞損、創(chuàng)傷、畸形等因素引起的關(guān)節(jié)軟骨退化及損傷，全球約有2.5億人患病，而其中又以膝關(guān)節(jié)最易受累。膝骨關(guān)節(jié)炎常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬，打軟腿，晚期易出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形、活動(dòng)嚴(yán)重受限等癥狀。隨著世界人口肥胖、老齡化等問(wèn)題日益嚴(yán)重，膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率呈增高趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界60歲以上人口男性發(fā)病率約為10%，女性發(fā)病率約為13%，患者生活質(zhì)量明顯下降[1]。目前膝骨關(guān)節(jié)炎的治療策略主要為階梯治療。膝骨關(guān)節(jié)炎早期可以通過(guò)理療、功能鍛煉、口服消炎止痛藥、關(guān)節(jié)內(nèi)注射皮質(zhì)激素等治療緩解癥狀[2]，改善生活質(zhì)量。膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展到晚期，關(guān)節(jié)軟骨磨損嚴(yán)重，關(guān)節(jié)疼痛嚴(yán)重，并可出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形，此時(shí)只能通過(guò)膝關(guān)節(jié)置換術(shù)來(lái)緩解疼痛癥狀，矯正畸形，提高運(yùn)動(dòng)能力。目前尚無(wú)一種方法能逆轉(zhuǎn)膝關(guān)節(jié)軟骨退變病理過(guò)程，從而徹底治愈膝骨關(guān)節(jié)炎。

既往觀點(diǎn)認(rèn)為，膝骨關(guān)節(jié)炎始動(dòng)因素主要為關(guān)節(jié)軟骨損傷和退變。近年有研究表明，膝骨關(guān)節(jié)炎是由全關(guān)節(jié)組織退變及功能失衡造成，其中包括關(guān)節(jié)軟骨損傷退變、關(guān)節(jié)滑膜炎癥、軟骨下骨重建、關(guān)節(jié)韌帶和半月板退變，以及關(guān)節(jié)周?chē)∪夂蜕窠?jīng)等病理變化，它們均對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[3]。而外泌體是一種由細(xì)胞分泌的有膜結(jié)構(gòu)的特殊微小囊泡，它作為一種生物信號(hào)傳遞的中介，在細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞，通過(guò)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞功能[4]。近年來(lái)大量研究表明，不同組織來(lái)源的內(nèi)生性外泌體在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用，同時(shí)不同干細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎能起到保護(hù)和治療的作用。

1 外泌體生物學(xué)特點(diǎn)

外泌體是一種由細(xì)胞分泌的特殊細(xì)胞外囊泡。細(xì)胞外囊泡包括凋亡小體(直徑500 nm ～2 mm)、微泡(直徑100～1 000 nm)及外泌體(直徑30～150 nm)。有學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)一種在成因、大小、成分等方面有獨(dú)立特點(diǎn)的細(xì)胞外囊泡，于是將其單獨(dú)分出來(lái)并定義為外泌體。外泌體直徑為30～150 nm，含有mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等多種RNA分子，以及脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種生物活性分子[5-6]。外泌體可通過(guò)其攜帶的這些生物活性大分子來(lái)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞生物學(xué)活性，并參與細(xì)胞分化、遷移免疫應(yīng)答、抗原提呈等方面的信號(hào)傳遞。

2 外泌體制備及鑒定

分離高純度的外泌體是進(jìn)行外泌體相關(guān)研究的關(guān)鍵步驟。目前外泌體分離方法有差速離心法、密度梯度離心法、過(guò)濾法、篩分分離法、免疫分離法、沉淀法等。每種方法都有自己的優(yōu)勢(shì)及不足，而其中差速離心法是外泌體分離最常用的技術(shù)之一。其步驟主要為低速離心去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片，然后中速離心以去除較大的囊泡，最后高速離心沉淀外泌體。高速離心力一般介于100 000～150 000 ×g 之間，這種方法能分離出純度較高的外泌體，缺點(diǎn)是其過(guò)程需要昂貴的高速離心機(jī)，同時(shí)高速離心也常會(huì)影響外泌體結(jié)構(gòu)，從而可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7]。

外泌體可以通過(guò)形態(tài)學(xué)分析、粒子大小分布及特異的結(jié)構(gòu)蛋白分析等方面進(jìn)行鑒定。透射電鏡分辨率可達(dá)0.1～0.2 nm，非常適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)的觀測(cè)。納米顆粒追蹤分析技術(shù)則可以體現(xiàn)樣本中所有外泌體的粒徑分布情況，快速、精準(zhǔn)地分析外泌體濃度粒徑，為外泌體存在提供有力證據(jù)。而通過(guò)蛋白免疫印跡(Western Blot)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)等技術(shù)則可以鑒定外泌體中的一些特殊標(biāo)志性蛋白，如CD9、CD63、CD81、HSP90等，為外泌體進(jìn)一步研究提供了有力的保障[8]。

3 不同組織來(lái)源外泌體對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的影響

3.1 軟骨細(xì)胞來(lái)源外泌體

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨組織中唯一的細(xì)胞種類(lèi)，多項(xiàng)研究表明軟骨細(xì)胞能分泌外泌體并對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展產(chǎn)生影響。Ni等[9]研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨組織分泌的外泌體能促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-1β，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞能分泌外泌體，從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)向軟骨細(xì)胞分化，而其作用機(jī)制是外泌體中的miR-8485通過(guò)調(diào)控BMSC的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞來(lái)源外泌體可以成功誘導(dǎo)軟骨祖細(xì)胞在皮下分化成為軟骨組織；體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，該外泌體能在抑制血管生成的同時(shí)，促進(jìn)軟骨祖細(xì)胞成軟骨分化，并使軟骨形成特異性標(biāo)志蛋白表達(dá)增加。這些研究結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞能分泌外泌體，軟骨細(xì)胞來(lái)源外泌體可介導(dǎo)軟骨細(xì)胞與靶細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，并對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程產(chǎn)生重要影響。

3.2 關(guān)節(jié)滑膜組織來(lái)源外泌體

關(guān)節(jié)滑膜對(duì)于膝關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)起了非常重要的作用。Kolhe等[12]在體外關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)中加入骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液分離出的外泌體，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞合成代謝相關(guān)基因表達(dá)降低，而分解代謝相關(guān)基因表達(dá)增加。Domenis等[13]成功從膝關(guān)節(jié)病患者關(guān)節(jié)液中分離出外泌體，并發(fā)現(xiàn)它能促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞釋放前炎癥因子。這提示關(guān)節(jié)液內(nèi)的外泌體對(duì)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展起促進(jìn)作用。Zhou等[14]對(duì)比骨關(guān)節(jié)炎患者及健康人關(guān)節(jié)液中外泌體組分，發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎組外泌體中miRNA-126-3p表達(dá)明顯下降，而miRNA-126-3p能促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化和增殖，并抑制IL-1β、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥因子表達(dá)，同時(shí)抑制軟骨細(xì)胞凋亡。

3.3 其他組織來(lái)源外泌體

肌腱是膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)重要組成部分，其中肌腱干細(xì)胞也能產(chǎn)生外泌體，可能對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生影響。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肌腱干細(xì)胞及其分泌的外泌體能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3及增加基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-3、Ⅰ型膠原蛋白α1表達(dá)，從而促進(jìn)肌腱組織修復(fù)。Zhao等[16]用脂多糖預(yù)處理牙周韌帶纖維母細(xì)胞，然后將其分離出的外泌體作用于MG-63成骨細(xì)胞，結(jié)果顯示其可上調(diào)IL-6及TNF-α水平，并抑制骨保護(hù)素生成，從而導(dǎo)致炎癥并抑制骨生成。因此，肌腱及韌帶組織內(nèi)產(chǎn)生的外泌體均可能對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的治療作用

既往有眾多研究表明BMSC或脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSC)能促進(jìn)軟骨細(xì)胞再生，有臨床研究顯示其治療膝骨關(guān)節(jié)炎的療效良好，但具體分子機(jī)制仍不十分清楚。越來(lái)越多的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用主要來(lái)源于其旁分泌的作用，其中就包括外泌體[17]。近期有多項(xiàng)研究表明，不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)骨關(guān)節(jié)炎均有明確的治療作用，它能減少軟骨內(nèi)炎癥因子產(chǎn)生，促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成，并延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[18-21]。

4.1 BMSC來(lái)源外泌體

BMSC來(lái)源外泌體能參與調(diào)節(jié)多項(xiàng)生理及病理過(guò)程，其中包括免疫反應(yīng)、血管生成、骨形成等。有研究表明，BMSC來(lái)源外泌體能促進(jìn)損傷組織如軟骨組織及軟骨下骨等修復(fù)。Cosenza等[22]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC來(lái)源外泌體能誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生Ⅱ型膠原蛋白，并抑制炎癥及分解代謝；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，BMSC來(lái)源外泌體對(duì)骨關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)軟骨有明顯的保護(hù)作用。Qi等[23]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC來(lái)源外泌體能被軟骨細(xì)胞吞入，并抑制IL-1β誘導(dǎo)的線粒體膜電位異常及細(xì)胞凋亡。Dong等[24]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC來(lái)源外泌體能抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷作用，這種保護(hù)作用是通過(guò)外泌體中miR-127-3p先抑制軟骨細(xì)胞CDH11，而后抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路完成的。Mao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-92a-3p的 BMSC來(lái)源外泌體能通過(guò)抑制WNT5A表達(dá)促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及軟骨基質(zhì)合成，活體實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這種外泌體對(duì)骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型關(guān)節(jié)軟骨起到明顯的保護(hù)作用。因此，通過(guò)調(diào)控BMSC來(lái)源外泌體分泌或通過(guò)基因修飾等手段調(diào)控外泌體內(nèi)容物可增強(qiáng)其治療膝骨關(guān)節(jié)炎的療效，為以后膝骨關(guān)節(jié)炎治療提供了很有前景的新方案。

4.2 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體

許多研究表明，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(SMSC)來(lái)源外泌體也具有較強(qiáng)的促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化能力。Zhu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，人SMSC能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及遷徙；在膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，關(guān)節(jié)腔注射SMSC來(lái)源外泌體能明顯延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。Tao等[27]研究發(fā)現(xiàn)，SMSC來(lái)源外泌體能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及遷移，但是它會(huì)抑制細(xì)胞外基質(zhì)生成，而高表達(dá)miR-140-5p的SMSC來(lái)源外泌體則能在促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的同時(shí)，避免對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)生成的抑制。

4.3 AMSC來(lái)源外泌體

由于對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)探查可以較容易地獲取髕下脂肪組織并從中提取AMSC，故近年來(lái)用AMSC及從中提取的外泌體治療膝骨關(guān)節(jié)炎的研究越來(lái)越多。Tofino-Vian等[28]研究發(fā)現(xiàn)，AMSC來(lái)源外泌體能下調(diào)衰老相關(guān)因子β-半乳糖苷酶活性，同時(shí)能抑制IL-6及前列腺素(PG)E2等炎性介質(zhì)釋放，因而對(duì)骨關(guān)節(jié)炎有保護(hù)作用。隨后他們從腹部吸脂手術(shù)的患者脂肪中分離提取出AMSC來(lái)源外泌體，從骨關(guān)節(jié)炎患者中提取關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，將軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)并添加IL-1β進(jìn)行刺激，然后進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體能明顯減少TNF-α、IL-6、PGE2 及一氧化氮等炎癥因子釋放，而抗炎因子IL-10及Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)明顯增多[29]。這一結(jié)果與之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。Wu等[30]從小鼠膝關(guān)節(jié)髕下脂肪墊中分離出AMSC來(lái)源外泌體，回輸入關(guān)節(jié)后發(fā)現(xiàn)其能減少細(xì)胞凋亡，增加軟骨基質(zhì)合成，減緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展；外泌體的這種保護(hù)作用主要源自其內(nèi)高濃度的miR-100-5p。

5 結(jié)語(yǔ)

外泌體在關(guān)節(jié)腔內(nèi)產(chǎn)生及釋放的分子機(jī)制尚不十分清楚，目前研究證實(shí)不同組織來(lái)源的外泌體對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生及發(fā)展都起到了重要的作用，因此探索外泌體在膝骨關(guān)節(jié)炎病理發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制將有助于篩選潛在的治療靶點(diǎn)。同時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體治療膝骨關(guān)節(jié)炎也展現(xiàn)出光明的前景。相信未來(lái)以外泌體為基礎(chǔ)的治療手段將不斷成熟完善，并使越來(lái)越多的膝骨關(guān)節(jié)炎患者受益。