何易祥 趙宇昊 高昭 張通 趙海燕 王文己

骨骼系統(tǒng)參與了人體內(nèi)諸多生理活動的調(diào)控，在維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括保護(hù)及支持其他器官、儲存和調(diào)節(jié)礦物質(zhì)、調(diào)節(jié)血液pH值等，其內(nèi)容納了造血干細(xì)胞及多種生長因子[1]。由嚴(yán)重外傷、骨骼畸形矯正、骨腫瘤切除等導(dǎo)致的骨結(jié)構(gòu)破壞需采取有效措施進(jìn)行治療，避免發(fā)生不愈合，影響人體功能[2]。目前臨床上廣泛采用的自體或異體骨移植方法尚存在諸多問題[3]，因此需探究是否有更有效的治療措施?；诮M織工程研制的生物材料可為人體提供具有良好性能、有助于修復(fù)受損骨組織、對人體無毒性作用的人工骨材料，在骨缺損修復(fù)中發(fā)揮重要作用。近年來隨著基因水平研究的不斷進(jìn)展，基于DNA分子特點(diǎn)研究有合適結(jié)構(gòu)且具有生物活性的生物材料逐漸成為骨組織工程研究的熱點(diǎn)。

1 DNA納米材料及骨修復(fù)

隨著基因研究的不斷進(jìn)展，基因治療技術(shù)被發(fā)現(xiàn)可用于治療多種疾病?；蛑委熜栌奢d體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)揮作用，以DNA分子為基礎(chǔ)的DNA納米技術(shù)隨之得到發(fā)展。Seeman[4]報(bào)道，核苷酸序列將優(yōu)先形成固定的連接而不是線性雙鏈，從而提出“結(jié)構(gòu)納米技術(shù)”概念。隨后他們首次自組裝合成了具有雙螺旋結(jié)構(gòu)邊的三維立方體DNA納米結(jié)構(gòu)[5]。此后多種形態(tài)的DNA立體結(jié)構(gòu)被相繼合成[6-12]。

DNA納米結(jié)構(gòu)的可編輯性及生物相容性等特點(diǎn)使其成為基因治療技術(shù)的熱點(diǎn)[13]。DNA分子在適宜的條件下，憑借獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)及高度特異性的堿基互補(bǔ)配對原則可進(jìn)行自組裝，將設(shè)計(jì)好的單鏈DNA組裝成多種形態(tài)的DNA納米結(jié)構(gòu)。它具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：①相較于DNA大分子，易穿透帶負(fù)電的細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)[14]；②由于以人體固有的DNA為原料，幾乎無細(xì)胞毒性作用[15]；③有豐富的修飾位點(diǎn)，可攜載多種生物分子進(jìn)入細(xì)胞[16]。

隨著基于納米技術(shù)的生物材料被開發(fā)，基因療法被廣泛應(yīng)用?；虔煼ㄅc骨組織工程相結(jié)合，即將成骨相關(guān)基因載入生物材料中形成復(fù)合體，隨后介導(dǎo)入胞發(fā)揮作用，從而在基因水平上刺激骨組織修復(fù)過程。Bara等[17]將強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的Tet-on腺病毒載體與骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSC)、纖維蛋白及雙相磷酸鈣陶瓷(MBCP)相結(jié)合用于修復(fù)裸鼠骨缺損，體內(nèi)研究臨界尺寸的股骨缺損中腺病毒BMP-2基因遞送對骨骼愈合的影響，通過調(diào)節(jié)強(qiáng)力霉素濃度調(diào)控BMP-2的表達(dá)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組缺損部位新骨形成明顯多于對照組，且不同的載體遞送方法(直接應(yīng)用與預(yù)包被MBCP顆粒)均可達(dá)到治療效果，強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的BMP-2表達(dá)通過軟骨內(nèi)骨化作用啟動骨愈合過程。此外，Li等[18]使用摻入BMP-2質(zhì)粒DNA的殼聚糖納米顆粒修復(fù)大鼠和比格犬骨缺損。Pan等[19]使用金納米顆粒作為載體研究miR-29b調(diào)節(jié)成骨作用的特性，結(jié)果顯示它在人體內(nèi)幾乎無細(xì)胞毒性，且可誘導(dǎo)成骨基因如RUNX2、OPN、OCN、ALP等的長期表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化。以上研究均顯示了生物材料介導(dǎo)的基因療法在骨組織修復(fù)中的有效性。

2 四面體DNA納米結(jié)構(gòu)組成

四面體DNA納米結(jié)構(gòu)(TDN)材料是一種通過DNA折紙技術(shù)形成的具有四面體結(jié)構(gòu)的DNA納米材料。2004年，Goodman等[8]首次設(shè)計(jì)合成TDN，其具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，且易于合成。

TDN合成是由4條預(yù)先設(shè)計(jì)相互配對的單鏈DNA等量加入緩沖液中，通過堿基互補(bǔ)配對原則，經(jīng)成熟的退火法操作，兩兩間相互配對折疊形成四面體。每條單鏈DNA的堿基分為3個(gè)小片段，各片段間使用不配對的堿基相隔，以保證頂點(diǎn)具有柔韌性，每條單鏈的1個(gè)小片段與另1條單鏈的1個(gè)小片段互補(bǔ)配對，形成四面體的1條邊。每條單鏈DNA的5′-端和3′-端交匯于四面體頂點(diǎn)或在邊上形成1個(gè)端口，交匯于頂點(diǎn)時(shí)，可在單鏈的5′-端或3′-端連接功能分子，實(shí)現(xiàn)其功能化；交匯于端口時(shí)，可添加功能分子修飾或使用DNA連接酶封閉端口。合成后的TDN可由聚丙烯酰胺凝膠電泳、原子力顯微鏡及動態(tài)光散射技術(shù)等進(jìn)行表征。

而Li等[20]使用1條含有286個(gè)核苷酸的單鏈DNA成功設(shè)計(jì)合成了TDN。該組裝過程簡化，易于擴(kuò)增，且具有較好的抵抗酶解特性，為合成TDN提供了新方法。

與其他DNA結(jié)構(gòu)相比，TDN能利用特殊的三維結(jié)構(gòu)，在有或沒有轉(zhuǎn)染劑的輔助下，均可有效進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞內(nèi)[14]，它通過小窩蛋白的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[21]，避免了原始DNA分子在沒有輔助劑的情況下難以大量進(jìn)入細(xì)胞的缺陷。

使用TDN進(jìn)行治療時(shí)，它需進(jìn)入體內(nèi)并在體內(nèi)環(huán)境中維持穩(wěn)定性，避免被過度降解消除。研究表明，二價(jià)離子可有助于平衡DNA螺旋結(jié)構(gòu)間的靜電排斥作用，因此在緩沖液中加入Mg2+可保持DNA納米結(jié)構(gòu)的完整性[22]。Mg2+濃度過高可使其過度聚集，過低則影響TDN合成，因此需進(jìn)一步探究適宜的Mg2+濃度。

3 TDN應(yīng)用

TDN已被證實(shí)有重要的功能，可通過DNA納米材料傳導(dǎo)生物活性分子如miRNA、siRNA、藥物等入胞發(fā)揮作用，且可調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，從而進(jìn)細(xì)胞增殖。

3.1 藥物運(yùn)輸

TDN結(jié)構(gòu)中的黏性末端可作為其他物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)用以構(gòu)建TDN復(fù)合物，介導(dǎo)功能性分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而發(fā)揮生物學(xué)功能。TDN由于能滲透入細(xì)胞膜且具有生物相容性和可降解性，因此可作為藥物運(yùn)輸載體，在修飾位點(diǎn)結(jié)合不同官能團(tuán)后可改變其藥物輸送能力。Li等[23]將抗癌適配體AS1411連接到TDN末端，組成Apt-TDN后，比較低氧狀態(tài)下Apt-TDN與TDN在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的定位及對細(xì)胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)Apt-TDN對腫瘤細(xì)胞有更好的靶向性，并能高效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生理作用，證實(shí)結(jié)合抗癌適配體AS1411可提高TDN的藥物輸送能力。Kim等[24]將TDN與阿霉素進(jìn)行結(jié)合，發(fā)現(xiàn)其更易遞送到靶細(xì)胞，可顯著抑制多重耐藥性(MDR)細(xì)胞生長。有研究將阿霉素插入經(jīng)過修飾的KLA-TDN后，KLA-TDN-阿霉素復(fù)合體靶向傳遞至線粒體，啟動了線粒體介導(dǎo)的程序性細(xì)胞凋亡途徑[25]。以上研究表明，結(jié)合不同的適配體可能發(fā)揮不同的作用或影響生物材料生理功能。

目前有研究將TDN作為基因載體與其他物質(zhì)結(jié)合。Lee等[26]將siRNA通過與TDN結(jié)合傳遞到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而靶向抑制腫瘤基因表達(dá)，該復(fù)合物在體內(nèi)有較長的半衰期，有助于分子發(fā)揮作用。Meng等[27]為增加DNA核酶被細(xì)胞攝取的能力，使用TDN作為載體，將Dz13序列直接添加到單鏈DNA的5′-末端，形成四面體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而將其介導(dǎo)入胞，結(jié)果顯示其具有高效的細(xì)胞攝取效率，且不影響Dz13活性，可靶向裂解c-Jun的mRNA，從而抑制鱗狀細(xì)胞癌生長。

3.2 生物分子檢測

攜載分子的三維DNA結(jié)構(gòu)也可用于檢測其他生物大分子。Hu等[28]將TDN結(jié)合到鏈霉親和素涂層的量子點(diǎn)(QD)，獲得了QD-Cy3-Texas Red-Cy5四面體DNA，并證實(shí)該物質(zhì)不僅可在復(fù)雜的生物樣品中同時(shí)均質(zhì)檢測多種核酸酶如HaeⅢ、EcoRV和Pvull等，而且可用于進(jìn)行多種酶抑制劑的篩選。Li等[29]將設(shè)計(jì)合成的TDN共價(jià)偶聯(lián)到玻璃表面，其顯示出良好的生物識別能力，可高度敏感和選擇性地檢測不同類型的生物活性分子如蛋白質(zhì)、miRNA等，且較為高效，應(yīng)用前景廣闊。

3.3 組織血管形成

實(shí)現(xiàn)組織血管化是進(jìn)行受損組織修復(fù)的重要部分。新生血管能將營養(yǎng)物質(zhì)輸送到代謝活躍的組織內(nèi)，促進(jìn)愈合，因此對骨修復(fù)具有重要作用[30]。血管生成是血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖形成具有血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的過程，體內(nèi)植入假體后，周圍組織炎性反應(yīng)將有助于誘導(dǎo)血管發(fā)生，但此過程速度較慢，不利于組織修復(fù)過程，而TDN可在此過程中增強(qiáng)血管生成作用。Zhao等[31]培養(yǎng)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞，使其暴露于250 nmol/L濃度的TDN中，發(fā)現(xiàn)TDN可進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞且促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)檢測到血管生成相關(guān)生長因子表達(dá)上調(diào)，并伴有Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活。

在糖尿病患者中，為防止致殘及降低截肢風(fēng)險(xiǎn)，對伴發(fā)的糖尿病傷口預(yù)防十分必要，傷口愈合過程中的血管化對于傷口恢復(fù)不可或缺。Lin等[32]研究發(fā)現(xiàn)，TDN可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，減輕炎癥，并經(jīng)Akt/Nrf2/血紅素加氧酶-1(HO-1)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過其抗氧化活性抵抗氧化損傷。

3.4 干細(xì)胞功能調(diào)節(jié)

對干細(xì)胞分化及功能進(jìn)行調(diào)節(jié)是骨組織工程研究的重點(diǎn)，TDN對于干細(xì)胞遷移及功能表達(dá)具有明顯作用。研究證實(shí)，TDN在脂肪來源干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及成骨分化的作用[33-37]。脂肪來源干細(xì)胞是一種由脂肪組織中分離得到的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，主要參與促進(jìn)組織細(xì)胞再生、加快組織細(xì)胞修復(fù)等。脂肪來源干細(xì)胞具有向成骨樣細(xì)胞分化的能力，與骨髓來源干細(xì)胞相比，其來源豐富，易于獲取且對患者損傷程度小，被視為理想的骨再生干細(xì)胞[38]。但單獨(dú)的脂肪來源干細(xì)胞沒有足夠的成骨能力，不能修復(fù)較大骨缺損，因此需與其他生物材料相結(jié)合以增強(qiáng)其成骨能力。Shi等[39]研究TDN對大鼠脂肪來源干細(xì)胞遷移的影響，發(fā)現(xiàn)TDN可顯著增強(qiáng)大鼠脂肪來源干細(xì)胞遷移，并下調(diào)長非編碼RNA(lncRNA)XLOC 010623，從而激活Tiam1和Rac1的mRNA表達(dá)。此外，TDN可上調(diào)RHOA、ROCK2和VCL的mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而證實(shí)TDN通過抑制lncRNA XLOC 010623轉(zhuǎn)錄并激活Tiam1/Rac1和RhoA/ROCK2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞遷移，且TDN促進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞遷移的作用呈濃度依賴性。Shao等[40]將脂肪來源干細(xì)胞暴露于TDN，發(fā)現(xiàn)其增殖和成骨分化作用增強(qiáng)，免疫熒光測定顯示有β-catenin表達(dá)，Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)上調(diào)，且暴露24 h后出現(xiàn)更強(qiáng)的熒光信號，表明TDN在脂肪來源干細(xì)胞分化增殖過程中具有重要作用，且經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是其發(fā)揮作用的重要機(jī)制，為基于脂肪來源干細(xì)胞骨缺損修復(fù)提供了新方向。

3.5 骨與軟骨細(xì)胞修復(fù)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的退行性關(guān)節(jié)軟骨病變，其病理過程伴隨著大量的軟骨細(xì)胞凋亡。因此，骨關(guān)節(jié)炎治療過程中應(yīng)關(guān)注軟骨細(xì)胞功能的修復(fù)。軟骨細(xì)胞凋亡和骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生與細(xì)胞自噬減少有關(guān)。TDN對細(xì)胞自噬有促進(jìn)作用。Shi等[41]研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞暴露于TDN后，在沒有輔助劑的情況下，TDN可以順利進(jìn)入軟骨細(xì)胞，且主要集中在軟骨細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。隨后，Shi等[42]成功合成TDN并使其進(jìn)入經(jīng)白細(xì)胞介素(IL)-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)TDN通過激活BCL2/BAX/caspase-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來減少軟骨細(xì)胞凋亡，通過激活Nrf2/HO-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制IL-1β誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，通過上調(diào)LC3-Ⅱ、Beclin1和Atg7增強(qiáng)自噬。此外，TDN還可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮軟化作用。以上研究表明，TDN作為生物材料可防止骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展，對骨關(guān)節(jié)炎有潛在的治療價(jià)值。

在骨組織工程研究中，利用生物材料對軟骨細(xì)胞表型及增殖過程進(jìn)行調(diào)節(jié)是一種有效的方法，以此可將軟骨細(xì)胞引向所需的位置，從而發(fā)揮功能。TDN可能會對軟骨細(xì)胞產(chǎn)生生物效應(yīng)，并促進(jìn)軟骨細(xì)胞向損傷部位運(yùn)動。Shi等[43]采用退火法合成TDN，使用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析和傷口愈合實(shí)驗(yàn)研究TDN對從大鼠關(guān)節(jié)軟骨分離的軟骨細(xì)胞運(yùn)動的影響，使用定量聚合酶鏈反應(yīng)、蛋白免疫印跡法和免疫熒光檢測相關(guān)基因及蛋白變化，證實(shí)TDN可增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活動能力，且RhoA、ROCK2和vinculin的mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，這種作用在TDN濃度為250 nmol/L時(shí)最為顯著，表明TDN結(jié)構(gòu)可能有助于軟骨修復(fù)過程，且與濃度相關(guān)。Shao等[44]使分離得到的小鼠軟骨細(xì)胞暴露于制成的TDN中，發(fā)現(xiàn)TDN能調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，同時(shí)出現(xiàn)與Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因和蛋白低表達(dá)及Ⅱ型膠原高表達(dá)。這些結(jié)果表明，TDN可能是軟骨增殖及功能調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)，可能可用于軟骨修復(fù)。

4 結(jié)語

已有諸多研究逐漸證實(shí)了TDN功能及其在骨組織分化過程中的作用，為解決臨床問題提供了新思路。但目前尚有諸多問題未能完全解決，如對骨髓來源的造血干細(xì)胞是否有積極作用及其機(jī)制如何、其結(jié)合位點(diǎn)是否能攜帶與成骨有關(guān)的因子、如何保持其在體內(nèi)的生物活性、能否對肌肉組織產(chǎn)生作用等，仍需進(jìn)行進(jìn)一步研究。