王 猛，金焱燕，蔡大敏，?，梅豐翌，張峰華，徐如嫣，張文翰

（1.天津市第一中心醫(yī)院，天津 300192 ；2.杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310000）

半個多世紀以來，人類一直使用抗生素治療由各種致病菌引起的感染性疾病。相關(guān)的調(diào)查結(jié)果顯示，濫用抗生素可增加對抗生素耐藥菌株的數(shù)量，進而降低抗生素的療效[1]。預(yù)計在不久的將來，因多種致病菌對抗生素抵抗，不僅會降低抗生素的療效，還會增加手術(shù)感染的發(fā)生率，進而導(dǎo)致患者出現(xiàn)因常見感染而死亡的情況。相關(guān)的調(diào)查結(jié)果顯示，近年來多種致病菌獲得抗生素抗性的速度在不斷地加快。有研究表明，將銅綠假單胞菌暴露在5 種常用抗生素中，并不斷增加這5 種抗生素的濃度，銅綠假單胞菌會迅速產(chǎn)生抗生素抗性[2]。另外，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、碳青霉烯抗性腸桿菌、耐萬古霉素腸球菌、多重耐藥假單胞菌和不動桿菌等病原菌均已產(chǎn)生了抗生素抗性。相關(guān)的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，抗生素耐藥菌株的增加是導(dǎo)致醫(yī)療費用增多的重要原因之一[3]。鑒于上述情況，用于治療由多重耐藥（multiple drug resistance，MDR）菌株所致感染的新治療策略亟待發(fā)掘。有研究表明，噬菌體、噬菌體內(nèi)溶素和抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）均具有抗菌作用，其療效均優(yōu)于抗生素，很有希望解決MDR 所致感染的治療問題。本次研究主要是從噬菌體、噬菌體內(nèi)溶素、AMPs的抗菌作用機制方面探討其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用情況。

1 噬菌體、噬菌體內(nèi)溶素和AMPs的抗菌作用機制

1.1 噬菌體的抗菌作用機制

噬菌體的發(fā)現(xiàn)是微生物學(xué)中的重大事件之一。弗雷德里克·威廉·特羅特在英格蘭（1915 年）、費利克斯·德赫勒在法國（1917 年）幾乎同時發(fā)現(xiàn)了噬菌體。而噬菌體的裂解能力則是由英國細菌學(xué)家恩斯特·漢金在1896 年首次發(fā)現(xiàn)的[4]。噬菌體是地球上最常見的生物顆粒，其在生物圈中以1030-1032的數(shù)量出現(xiàn)，是現(xiàn)存的最大病毒群[5]。噬菌體是能夠侵襲細菌、真菌、藻類、放線菌或螺旋體等微生物的一類病毒的總稱。噬菌體可滲透到其宿主細菌的細胞內(nèi)，引起特異性感染，使宿主細菌的細胞出現(xiàn)代謝紊亂而發(fā)生裂解，通過破壞宿主細菌的細胞起到抗菌作用。在2007 年，有5500 余種原核病毒通過電鏡觀察被發(fā)現(xiàn)，其中約有99.6%的原核病毒為噬菌體[6]。1967 年布拉德利首次對噬菌體進行了分類，其區(qū)分出了有尾噬菌體、三種等長噬菌體和烈性噬菌體三組噬菌體。有研究表明，約有96%的噬菌體為有尾噬菌體。而多面體噬菌體、多形性噬菌體及烈性噬菌體則很少見，其宿主細菌的范圍也很窄[5]。隨著電鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，病毒的分類變得非常精確。目前，微生物學(xué)將噬菌體的分類方案規(guī)定為1 目13 科34 種[7]。按照衣殼中所發(fā)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的類型，噬菌體可分為四大類：單鏈DNA 噬菌體、雙鏈DNA 噬菌體、單鏈RNA 噬菌體和雙鏈RNA 噬菌體。在宿主細菌進行復(fù)制的過程中，噬菌體以裂解循環(huán)(毒性噬菌體)或溶原循環(huán)(溫和噬菌體)的形式發(fā)生。裂解循環(huán)的形式通常以新病毒粒子的產(chǎn)生和細菌的細胞受到破壞結(jié)束（發(fā)生裂解），唯一的例外是Inoviridae 家族中的烈性噬菌體可不經(jīng)細胞裂解持續(xù)釋放子代噬菌體。溶原循環(huán)的形式是在溶原狀態(tài)下，噬菌體的基因組整合至細胞的DNA 中或以質(zhì)粒的形式游離潛伏在細胞內(nèi)，當(dāng)細胞內(nèi)環(huán)境的平衡被打破時，噬菌體產(chǎn)生及細胞裂解的階段就開始了。毒性有尾噬菌體的生命周期是一個多步驟的過程，包括吸附階段、細胞感染噬菌體DNA 階段、噬菌體在細胞內(nèi)增殖階段和最后釋放新的可感染噬菌體階段[8]。噬菌體療法是指通過噬菌體裂解對抗致病菌的一種治療方法。該療法可有效地抑制各種致病菌（包括對抗生素耐藥的致病菌菌株）的活性，其主要特點是：1）與抗生素療法的作用機制不同，該療法具有特定的對抗致病菌所致感染的作用機制。2）該療法的抗菌譜狹窄，可選擇性地殺死宿主致病菌，且不會對機體內(nèi)的其他微生物產(chǎn)生不良影響。3）噬菌體能夠在發(fā)生感染的部位進行增殖[9]。使用噬菌體療法對抗致病菌的優(yōu)勢是：1）噬菌體能夠迅速地對對應(yīng)出現(xiàn)的細菌突變體進行抵抗，這與噬菌體發(fā)生突變的頻率遠遠高于細菌發(fā)生突變的頻率有關(guān)。2）與使用抗生素相比，使用噬菌體療法治療感染性疾病的醫(yī)療成本更低。3）噬菌體療法的副作用非常少見[10]。大量的研究結(jié)果證實，采用噬菌體療法對抗耐藥細菌具有巨大的潛力[11]。相關(guān)的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，噬菌體產(chǎn)品的潛在應(yīng)用領(lǐng)域不僅包括臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，還包括了食品領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[12-13]。目前，噬菌體產(chǎn)品在食品安全領(lǐng)域已獲得了美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的批準[14]。2006 年第一個噬菌體產(chǎn)品ListShield 注冊上市。ListShield是由幾種噬菌體組成的對抗單核增生李斯特菌的產(chǎn)品，而單核增生李斯特菌主要污染肉類產(chǎn)品和家禽類產(chǎn)品。另外，已經(jīng)上市的噬菌體產(chǎn)品還有Listex P100和AgriPhage，這兩種產(chǎn)品主要應(yīng)用于對抗番茄和胡椒葉的細菌斑點。2008年FDA 第一次批準了噬菌體療法的第一階段臨床試驗。這些臨床試驗主要是將八種噬菌體混合，再將其用于對抗各種致病菌所致感染性疾?。ㄈ珈o脈性腿部潰瘍合并金黃色葡萄球菌感染、銅綠假單胞菌感染和大腸桿菌感染等），最終的結(jié)果證實了噬菌體療法的有效性和安全性，并為進一步開展噬菌體療法的臨床試驗提供了可靠的參考[15]。但是，噬菌體療法也存在以下問題：1）宿主細菌細胞的快速裂解，可能會導(dǎo)致大量內(nèi)毒素的釋放。2）缺乏部分噬菌體對毒素進行編碼能力的相應(yīng)藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)。3）宿主細菌免疫系統(tǒng)內(nèi)的噬菌體易被中和。4）裂解后的噬菌體可向溶元噬菌體發(fā)生轉(zhuǎn)化，致使宿主細菌對溶解噬菌體的攻擊產(chǎn)生“抵抗力”，這可能會改變宿主細菌的毒性作用。

1.2 噬菌體內(nèi)溶素的抗菌作用

噬菌體內(nèi)溶素是指烈性噬菌體在裂解宿主細菌后期釋放子代噬菌體的過程中產(chǎn)生的帶有編碼的一類蛋白，具有裂解細菌細胞壁的作用。噬菌體內(nèi)溶素屬于細菌的水解蛋白，能夠破壞細菌細胞壁中的成分，使宿主細菌細胞釋放噬菌體的后代。肽聚糖(peptidoglycan，PG) 是一種有能力編碼的噬菌體水解酶的裂解酶，其用于感染和/ 或釋放細菌宿主細胞的子代病毒顆粒。與噬菌體顆粒相關(guān)的PG 水解酶，可能會導(dǎo)致所謂的“從無裂解”，即裂解發(fā)生在沒有完整裂解感染周期的情況下。PG 裂解的結(jié)構(gòu)蛋白主要與噬菌體的尾部相關(guān)，可使局部細胞的細胞壁降解后引起感染。在宿主細菌細胞發(fā)生感染周期的后期，噬菌體可編碼PG 水解酶，這屬于細胞裂解過程的一部分。有研究表明，孔蛋白可導(dǎo)致細胞的細胞膜發(fā)生穿孔，使細胞質(zhì)中積累的內(nèi)溶蛋白獲得PG，進而促進細菌細胞的裂解和子代噬菌體的釋放。這類帶有編碼的PG 水解酶可使細菌細胞的內(nèi)部發(fā)生裂解，被稱為內(nèi)溶素或細胞溶解酶[16]。噬菌體內(nèi)溶素的結(jié)構(gòu)與細菌細胞PG的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在革蘭氏陰性細菌中，PG 主要以缺乏表面蛋白或碳水化合物的薄層形式存在。多數(shù)革蘭陰性菌中的噬菌體產(chǎn)生的細胞溶解酶為球狀蛋白。該蛋白的大小為15～20 kDa，僅由一個催化域組成。在革蘭陽性菌中，噬菌體有一層厚厚的PG，其中含有交叉鍵、表面碳水化合物和蛋白質(zhì)。革蘭陽性菌的噬菌體內(nèi)溶素具有一個（或多個）催化域和一個能夠識別目標生物體細胞表面表位的結(jié)合域，常特異性地與菌株或物種相結(jié)合[17]。有研究表明，噬菌體內(nèi)溶素通常連接催化域和結(jié)合域，是一個靈活的、跨結(jié)構(gòu)域連接的序列[14]。噬菌體內(nèi)溶素對細菌細胞的外源性作用是：可在沒有高滲透壓存在的情況下，誘導(dǎo)細菌細胞的裂解[18]。此項研究是將純化的噬菌體內(nèi)溶素作為對抗革蘭陽性菌有效的抗菌劑的開始。革蘭陰性菌因有細胞外膜的存在，通常需使用表面活性劑或其他額外機制允許的溶解酶穿過細胞的外膜。但是，相關(guān)的文獻中也有關(guān)于將噬菌體細胞溶解酶與其他試劑融合后，產(chǎn)生對抗革蘭陰性菌作用的報道[19]。

1.3 AMPs的抗菌作用機制

AMPs 是多數(shù)物種先天免疫反應(yīng)的一個組成部分，其構(gòu)成了生物體的固有免疫組成成分，具有廣泛的抗菌活性。AMPs 幾乎存在于所有的生物體中，即從細菌至植物、無脊椎動物和脊椎動物的生物體中[20]。目前，已有數(shù)百種的天然 AMPs 被分離出來[21]。AMPs 具有免疫調(diào)節(jié)的特性，對生物體的先天免疫和炎癥反應(yīng)具有至關(guān)重要的作用[22]。AMPs 最廣為人知的特性是其潛在的抗菌性。近幾十年來，AMPs 作為抗生素的替代品（特別是在治療耐藥菌株所致感染方面）被廣泛研究[23]。AMPs的種類繁多，這與其在宿主體內(nèi)具有多種多樣的抗菌活性有關(guān)[24]。各種生物體中AMPs的共同特征是：1）AMPs的分子量相對較小，最多包含100 個氨基酸。2）由精氨酸、賴氨酸和/或組氨酸殘基的存在決定了AMPs 帶有正電荷。由于AMPs 帶有正電荷，故也被稱為陽離子AMPs。3）AMPs 具有親水脂結(jié)構(gòu)的能力，其特征是存在疏水和親水的結(jié)構(gòu)域。AMPs的分類標準包括：1）按照生物合成的途徑，AMPs 可分為核糖體合成AMPs和非核糖體合成AMPs。2）按照來源，AMPs 可分為昆蟲AMPs、哺乳動物AMPs、兩棲動物AMPs、植物AMPs、細菌AMPs 及魚類、軟體動物、甲殼類來源的AMPs 六類。3）AMPs 最常見的分類方法是基于其二級結(jié)構(gòu)的分類[25]。按照二級結(jié)構(gòu)，AMPs可分為四組：⑴線性AMPs。⑵α-螺旋結(jié)構(gòu)（蛙皮素，LL-37）肽。⑶β-折疊肽。⑷線狀肽。線狀肽具有擴展結(jié)構(gòu)，是以一種或多種氨基酸(富含色氨酸和脯氨酸/精氨酸殘基的吲哚烷和牛AMPs-5)和環(huán)狀結(jié)構(gòu)肽為主的AMPs。線狀肽中包括羊毛硫抗生素(主要是尼生素)。羊毛硫抗生素是絲氨酸、蘇氨酸殘基側(cè)鏈經(jīng)翻譯后脫水，與半胱氨酸反應(yīng)形成非典型氨基酸羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸，再與硫醚橋接形成的環(huán)狀肽。另外，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽也可以是由一個二硫化物橋 (如乳鐵蛋白肽B和牛AMPs-1 等)形成的。有研究表明，AMPs 二級結(jié)構(gòu)的生物活性與其對細胞膜的影響密切相關(guān)。4）AMPs 還可按照優(yōu)勢氨基酸的殘基進行分類。有研究表明，許多細菌AMPs的抗菌機制是對細胞膜進行降解，這與蛋白質(zhì)和磷脂的負電荷官能團的靜電吸引有關(guān)[26]。但是，有證據(jù)表明，AMPs 對某些細胞合成的進程有抑制作用，如核酸和蛋白質(zhì)的合成、酶活性和細胞壁合成[27]?？紤]到AMPs的抗菌作用機制，細菌對AMPs 產(chǎn)生耐藥性較為困難，這與細菌細胞需要在磷脂膜的組成和/或結(jié)構(gòu)中發(fā)生劇烈的改變有關(guān)[28-29]。部分研究人員發(fā)現(xiàn)，微生物體能夠顯示出對AMPs產(chǎn)生耐藥性的能力，如蛋白的水解降解機制、由細菌捕獲或排出AMPs 及微生物負表面電荷的部分減少等[30-32]。另外，也有其他促進致病菌對AMPs 產(chǎn)生耐藥性的機制，如形成生物膜保護的致病菌、或改變革蘭陰性菌外膜流動性導(dǎo)致其滲透性降低等機制[33-34]。

2 噬菌體、噬菌體內(nèi)溶素和AMPs 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用情況

致病菌對抗生素抵抗的問題目前已成為主要的臨床問題，需積極尋找抗生素療法以外治療致病菌所致感染性疾病的新策略。因此，對噬菌體、噬菌體內(nèi)溶素和AMPs 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用情況做如下介紹。

2.1 噬菌體顯示技術(shù)的應(yīng)用情況

近年來，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)的引進和發(fā)展，我國對各種新藥的研發(fā)均取得了很大的進展。1985 年史密斯等引入的噬菌體顯示技術(shù)，在藥物科學(xué)中發(fā)揮了重要的作用。噬菌體顯示技術(shù)是指利用基因工程手段通過產(chǎn)生噬菌體群體(噬菌體文庫)，使工程噬菌體的表面產(chǎn)生隨機序列的多肽、蛋白或抗體的一種顯示技術(shù)。從一個大的種群中，噬菌體能夠選擇性地結(jié)合到目標宿主病毒(生物合成)，而隨機引入的噬菌體基因組cDNA 序列被表達后形成融合肽，并將其連接到構(gòu)建噬菌體外殼的表面蛋白上，融合肽會顯示在病毒體之外，而引入的DNA 則會留在噬菌體的顆粒內(nèi)。噬菌體顯示技術(shù)是研發(fā)新藥的一種有效工具，其主要作用是識別具有新功能的配體，而噬菌體文庫的開發(fā)則是發(fā)現(xiàn)抗菌治療新組分的重要研究進展。目前，采用噬菌體顯示技術(shù)已篩選出了結(jié)構(gòu)和功能齊全的酶，并分離出一系列能與給定因子特異性結(jié)合的多肽。這些分離肽在體外試驗中均被證明是有效的酶功能抑制劑，可用于評估酶的活性或研發(fā)將其作為組成部分的多肽藥物。有研究表明，使用噬菌體顯示技術(shù)獲得的肽，能夠抑制細菌細胞內(nèi)靶蛋白的功能。相關(guān)的試驗結(jié)果證實，在選擇了嚴格調(diào)控啟動子的控制下，以s-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合的方式表達具有已知功能關(guān)鍵靶點的肽段，宿主細菌細胞內(nèi)特異性靶蛋白的失活可抑制細菌的生長。

2.2 噬菌體、噬菌體內(nèi)溶素和AMPs 聯(lián)合應(yīng)用的可能性

有研究表明，單一使用噬菌體、噬菌體內(nèi)溶素和AMPs的抗菌作用存在部分受限的缺點，而共同應(yīng)用噬菌體、噬菌體內(nèi)溶素和AMPs 進行抗菌處理時可起到協(xié)同效應(yīng)。這是因為，將噬菌體編碼的AMPs 作為一組特定的AMPs 形式應(yīng)用，可消除將噬菌體、噬菌體內(nèi)溶素和AMPs 作為單一特異性抗菌藥所造成的許多限制。有研究人員對聯(lián)合應(yīng)用尼生素和兩種裂解噬菌體抑制金黃色葡萄球菌活性的效果進行了研究，結(jié)果顯示，在巴氏殺菌牛奶中確實可觀察到噬菌體、噬菌體內(nèi)溶素和AMPs 殺滅病原菌的協(xié)同效果，但其中的耐尼生素細菌會對噬菌體的活性產(chǎn)生負面影響。這與細菌表面發(fā)生的炎癥反應(yīng)可能使其對尼生素產(chǎn)生耐藥變化，從而干擾了噬菌體受體的結(jié)合或識別等因素有關(guān)。耐尼生素菌株的疏水性較差，且?guī)в休^高的正電荷，這與其缺乏細胞色素c 與尼生素的結(jié)合表達有關(guān)。耐尼生素菌株對尼生素失去抵抗力后，可恢復(fù)對噬菌體的敏感性。這是由于其對噬菌體不敏感的突變體對尼生素沒有耐藥性所致。上述研究的結(jié)果表明，將尼生素與乳制品中發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌噬菌體聯(lián)合應(yīng)用的可能性有限。有研究小組將由鮑氏不動桿菌噬菌體ФAB2編碼的細胞內(nèi)溶素LysAB2的C 端兩親性螺旋區(qū)合成了4 個腺嘌呤的核糖核苷酸（adenosine monophosphate，AMP），這些多肽多核苷酸均表現(xiàn)出對鮑曼不動桿菌很強的抗菌活性 (MIC 4-64μM)。這些鮑曼不動桿菌中包括一些多重耐藥的鮑曼不動桿菌和耐多粘菌素的鮑曼不動桿菌。在四種AMP中，LysAB2 P3 經(jīng)修飾后其凈荷增加，疏水性降低，對鮑曼氏桿菌有較高的抗菌活性，但對正常真核細胞的溶血活性較低，無細胞毒活性。有研究人員對AMPs 進行了電鏡和熒光素異硫氰酸酯染色實驗，結(jié)果顯示LysAB2 P3 能夠通過細胞膜的滲透作用殺死鮑曼原蟲。另外，在進行小鼠腹腔感染模型實驗的過程中，為小鼠注射鮑氏不動桿菌噬菌體ФAB2 編碼的細胞內(nèi)溶素LysAB2的4 個小時后，LysAB2 P3 可使其腹腔液體中細菌的數(shù)量減少13 倍，使其血液中細菌的數(shù)量減少27 倍，而且LysAB2 P3 還可使約60%嚴重感染鮑曼氏桿菌的小鼠免于發(fā)生致命性菌血癥[35]。上述研究的結(jié)果表明，噬菌體內(nèi)溶素是一種很有發(fā)展前景的有效AMP。噬菌體編碼的AMPs 是一類特殊的抗感染藥物，除了能夠使真核生物與細菌產(chǎn)生AMPs，還可形成一類被命名為噬菌體編碼的AMPs化合物。噬菌體編碼的AMPs 包括兩種類型：1）噬菌體編碼的裂解因子和噬菌體尾部復(fù)合物。這些復(fù)合物來自小基因組構(gòu)成的單鏈DNA 或RNA的噬菌體，類似于大型裂解噬菌體內(nèi)溶素-穴蛋白系統(tǒng)的組成。2）噬菌體編碼的AMP 噬菌體尾部復(fù)合物。這些復(fù)合物是肽亞基的大分子聚合物，其負責(zé)識別和結(jié)合具體的表面受體,通過致病菌細胞外膜的滲透與原位裂解細胞壁的肽聚糖位點相結(jié)合,再介導(dǎo)噬菌體的基因組進入致病菌的細胞內(nèi)。這說明，將噬菌體尾部復(fù)合物作為替代抗菌劑的可能性似乎是真實存在的，特別是對革蘭陰性菌可通過穿透細胞外膜的機制開始發(fā)揮作用。有研究人員從一個大的10-mer 噬菌體肽庫中，選擇了與整個大腸桿菌細胞結(jié)合的AMPs，其中一種多肽以單體和樹突狀兩種形式被分離合成，而且樹突狀多肽的抗菌活性遠遠高于單體形式多肽的抗菌活性。另外，該研究人員還通過氨基酸的殘基取代或鏈縮短的形式對AMPs的原序列進行了修飾，結(jié)果顯示這三種不同的AMPs 比自然降解的AMPs 具有更強的抵抗力，其對大量的革蘭陰性菌具有更強的殺菌活性，對血液蛋白酶具有更高的耐藥性，溶血的活性較低，對真核細胞的細胞毒性較弱，有望成為新的抗菌藥。

3 小結(jié)

本文探討了近年來對噬菌體、噬菌體內(nèi)溶素和AMPs在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究進展，認為這三種藥物可能會構(gòu)成一種新型的抗菌藥。這種新型的抗菌藥有助于對抗感染，包括由MDR 菌株引起的細菌感染。與傳統(tǒng)的抗生素相比，這種新型的抗菌藥具有顯著的優(yōu)勢，這是因為溶原噬菌體能夠用于廣泛地表達具有生物活性的多肽，可將其作為抗菌藥、抗原或抗癌藥的載體。但是，目前有關(guān)AMPs 與溶菌噬菌體的直接相互作用、AMPs 對臨床相關(guān)病原體溶解酶的研究有限，需在今后的研究中對此進行更廣泛的研究，以便為解決致病菌對抗生素抵抗的問題提供參考。