劉夢(mèng)瑤 姜立新

外泌體是一種由各種細(xì)胞分泌的直徑為30～150nm的循環(huán)胞外囊泡，其生物發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，通過(guò)“內(nèi)吞-融合-胞吐”等一系列過(guò)程調(diào)節(jié)外泌體生成和組裝，最終被釋放至細(xì)胞外間隙或生物體液中。外泌體可攜帶多種膜蛋白、胞質(zhì)蛋白、脂質(zhì)、DNA和RNA等，參與細(xì)胞間通訊，具有多種生物學(xué)功能及廣泛的臨床應(yīng)用[1]。然而由于外泌體的納米尺寸和高度特異性，如何有效地對(duì)外泌體進(jìn)行活體示蹤，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)外泌體在體內(nèi)外的生物學(xué)行為，是外泌體研究中十分重要的部分。

一、外泌體的生物發(fā)生

外泌體最早發(fā)現(xiàn)于1985年，由各種正常和腫瘤細(xì)胞從質(zhì)膜釋放出的直徑為30～150nm的循環(huán)胞外囊泡，廣泛存在于血液、尿液、唾液和母乳等多種生物體液中[1,2]。外泌體的形成過(guò)程較為復(fù)雜，先由細(xì)胞外成分如蛋白質(zhì)、脂類、代謝物、小分子等，通過(guò)內(nèi)吞作用和質(zhì)膜內(nèi)陷，與細(xì)胞表面蛋白一起由外向內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞形成早期分選核內(nèi)體(early sorting endosomes，ESEs)，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體預(yù)先形成的ESEs融合。之后ESEs發(fā)展成熟為晚期分選核內(nèi)體(late sorting endosomes，LSEs)，LSEs膜向腔內(nèi)出芽形成包含諸多外泌體的多泡體(multivesicular bodies，MVBs)。MVBs除變成自噬小體及被溶酶體降解外，還可通過(guò)細(xì)胞骨架和微管網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜，通過(guò)胞吐作用釋放腔內(nèi)外泌體到細(xì)胞外環(huán)境中[3]。此時(shí)的外泌體表面表達(dá)細(xì)胞膜蛋白，內(nèi)部包裹細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物，即使同一細(xì)胞來(lái)源的外泌體，其大小及內(nèi)容物種類和含量也有所不同。外源性外泌體則通過(guò)凹陷、網(wǎng)格蛋白陷窩、脂閥、大胞飲、吞噬作用、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、直接結(jié)合、直接融合等方式進(jìn)入受體細(xì)胞[3]。這一復(fù)雜的重構(gòu)過(guò)程導(dǎo)致外泌體攜帶多種膜蛋白(如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1即GPC1、四分子交聯(lián)體超蛋白家族 CD47、CD63等)、胞質(zhì)蛋白、脂質(zhì)、DNA、mRNA和miRNA，是人體內(nèi)多功能的細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，影響細(xì)胞生物學(xué)的各個(gè)方面。

二、外泌體的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

外泌體與免疫反應(yīng)、病毒病理學(xué)、妊娠、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥進(jìn)展密切相關(guān)[4，5]。由外泌體傳遞到受體細(xì)胞的蛋白質(zhì)、代謝物和核酸改變細(xì)胞的生物反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)或抑制疾病。外泌體在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路方面的固有特性使其在許多疾病的治療方面具有潛在應(yīng)用，包括神經(jīng)退行性疾病和癌癥。外泌體具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)特性、生物相容性和較少的不良反應(yīng)。因此可在生物體內(nèi)運(yùn)輸多種物質(zhì)，包括小干擾RNA(siRNA)、反義寡核苷酸、化療藥物和免疫調(diào)節(jié)劑等，并將其遞送到靶細(xì)胞發(fā)揮治療效應(yīng)。Kamerkar等[6]利用間充質(zhì)細(xì)胞的外泌體制備了包載KrasG12D siRNA的工程化外泌體，通過(guò)CD47對(duì)胰腺癌細(xì)胞的特異性靶向作用精準(zhǔn)遞送干擾Kras表達(dá)的siRNA，最終顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，提高小鼠的總體生存率。

除此之外，外泌體也可用于疾病診斷，基于外泌體表面蛋白的液體活檢在癌癥和其他疾病的診斷和預(yù)后上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。如GPC1富集在腫瘤外泌體中，可用來(lái)診斷胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等，循環(huán)外泌體的數(shù)量變化也可反映腫瘤的治療效果[7,8]。疾病的進(jìn)展和治療反應(yīng)也可通過(guò)外泌體的多組分分析來(lái)確定。目前正在考慮將表面蛋白、脂質(zhì)、DNA和miRNA聯(lián)合用于癌癥診斷和預(yù)后評(píng)估，增強(qiáng)診斷的特異性和敏感度。

三、外泌體的活體成像方法

外泌體活體示蹤是用示蹤劑(如有機(jī)染料、熒光蛋白、造影劑、核素等)標(biāo)記外泌體，用特定的影像學(xué)方法對(duì)動(dòng)物體內(nèi)外泌體進(jìn)行追蹤，從而觀察外泌體在體內(nèi)的生物學(xué)行為。目前常用的活體成像方法包括光學(xué)成像、磁共振成像、放射性核素分子成像、光聲成像及多模態(tài)成像。

1.光學(xué)成像：生物發(fā)光成像(bioluminescence imaging，BLI)和熒光成像(fluorescence imaging，F(xiàn)LI)是在可見光光譜(390～700nm)范圍內(nèi)檢測(cè)外泌體的兩種主要的光學(xué)成像方法[9]。BLI是由自身合成的熒光素酶催化人為注射的熒光素底物而產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光成像方法，需要超敏感的CCD相機(jī)采集生物發(fā)光信號(hào)。FLI利用有機(jī)染料或熒光蛋白在外部光源的激勵(lì)下發(fā)出信號(hào)而成像。與BLI比較，CCD相機(jī)更容易檢測(cè)到FLI信號(hào)，因此BLI和FLI都可用于外泌體的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

生物發(fā)光成像:生物發(fā)光成像可在活體條件下對(duì)同一動(dòng)物體進(jìn)行連續(xù)觀察，其優(yōu)點(diǎn)是活體實(shí)時(shí)、無(wú)放射性、成像范圍廣。熒光素酶催化熒光素的反應(yīng)必須要在外源性熒光素及內(nèi)源性氧氣和ATP存在的條件下，才能在活細(xì)胞中進(jìn)行。Luo等[10]在心肌細(xì)胞特異性αMHC增強(qiáng)子后加哺乳動(dòng)物基因條件性表達(dá)載體質(zhì)粒載體(LoxP-Stop-LoxP)，建立了穩(wěn)定表達(dá)CD63-納米熒光素酶(NanoLuc)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，用于時(shí)空標(biāo)記心肌來(lái)源的外泌體；并將轉(zhuǎn)基因小鼠與他莫昔芬誘導(dǎo)的Cre小鼠(CreERT2-Rosa)雜交，獲得他西莫芬誘導(dǎo)表達(dá)CD63-NanoLuc報(bào)告基因的雜交小鼠模型；最后通過(guò)BLI成像研究了心肌細(xì)胞外泌體的特異性標(biāo)記和組織分布情況，為后續(xù)的外泌體研究提供了有效工具。然而BLI成像往往需要構(gòu)建復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株或動(dòng)物模型，對(duì)檢測(cè)儀器的精密度也有較高要求。

熒光成像:目前，外泌體熒光成像常以有機(jī)染料和熒光蛋白兩種方法標(biāo)記外泌體(包括外泌體膜和內(nèi)容物)，以小動(dòng)物(包括視窗模型動(dòng)物和模式動(dòng)物等)為研究對(duì)象，借助激光共聚焦顯微鏡和小動(dòng)物活體熒光成像儀進(jìn)行外泌體可視化研究[11]。

有機(jī)染料標(biāo)記技術(shù)主要用于研究外泌體的細(xì)胞攝取及體內(nèi)分布。常用的有機(jī)染料主要包括PKH家族如PKH26/67、Alexa 488/633、Cy3/5/7和Dil/Dio/DiR等。Chen等[12]針對(duì)Hela細(xì)胞外泌體中的兩種miRNA(mir-21和mir-31)分別制備了兩種分子信標(biāo)，即Cy5修飾的MB21和Alexa Fluor 488修飾的MB31。然后將CM-Dil膜標(biāo)記的外泌體與受體細(xì)胞孵育，通過(guò)單分子定位顯微鏡(single molecule localization microscopy，SMLM)實(shí)現(xiàn)了外泌體和miRNA的活細(xì)胞動(dòng)態(tài)追蹤，且成功觀察到外泌體在受體細(xì)胞間絲狀結(jié)構(gòu)中的移動(dòng)。然而，這類方法存在染料聚集、內(nèi)(外)源性雜質(zhì)混入等造成非特異性熒光信號(hào)混淆的缺點(diǎn)。

另一種標(biāo)記方法是通過(guò)熒光蛋白標(biāo)記外泌體，主要用于研究外泌體釋放、吸收、內(nèi)容物遞送等過(guò)程。Lai等[13]通過(guò)插入棕櫚酰化序列的熒光蛋白標(biāo)記腫瘤細(xì)胞膜，研究其分泌的外泌體在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)行為，并通過(guò)活細(xì)胞共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群之間的外泌體交換，通過(guò)多光子活體顯微鏡(multi-photon intravital microscopy，MP-IVM)技術(shù)完成了對(duì)腫瘤脊背視窗模型內(nèi)外泌體在體可視化觀察，此外還觀察到外泌體內(nèi)RNA被受體細(xì)胞攝取的動(dòng)態(tài)過(guò)程。然而，由于熒光蛋白標(biāo)記效率低、半衰期短，給后期在體成像帶來(lái)了一定挑戰(zhàn)。

除視窗模型動(dòng)物外，模式動(dòng)物也常用于研究外泌體動(dòng)態(tài)活動(dòng)，斑馬魚因其個(gè)體小、組織層薄、同源性高等特點(diǎn)，成為外泌體活體成像的良好對(duì)象。何文慧[14]利用吖啶酮類熒光探針MAA在酸性條件下易與帶負(fù)電的外泌體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中的外泌體成像；探針能以吞咽和皮膚吸收的方式進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)，使其頭、腹、尾部均顯示綠色熒光。

2.磁共振成像(MRI)：MRI因其空間分辨率高、無(wú)輻射等優(yōu)點(diǎn)成為外泌體活體示蹤的有效手段之一。外泌體須用MRI造影劑標(biāo)記以達(dá)到成像目的，常用造影劑包括超小順磁性氧化鐵納米顆粒(ultrasmall superparamagnetic iron oxides，USPIO)、釓劑和鐵劑等。Busato等[15]通過(guò)創(chuàng)新性標(biāo)記外泌體使其在MRI成像同時(shí)保持形態(tài)和生理特征。首先使用4～6nm的USPIO對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記(200g Fe/ml USPIO，72h孵育)，之后從脂肪干細(xì)胞中分離包含USPIO的外泌體，最后實(shí)現(xiàn)外泌體的體內(nèi)和體外MRI成像，成像下限分別為3g和5g外泌體。Liu等[16]設(shè)計(jì)了一種由鐵蛋白重鏈(FTH1)和內(nèi)貼蛋白兩部分組成的融合蛋白，其中FTH1用作MRI造影劑；之后用攜帶融合蛋白的慢病毒感染間充質(zhì)干細(xì)胞，并分離外泌體用于動(dòng)物體內(nèi)MRI成像。雖然MRI成像分辨率高，但敏感度較低，需大量外泌體才可成像，在技術(shù)上存在著很大的挑戰(zhàn)。Jung等[17]用USPIO和奧拉帕尼修飾低氧條件下的乳腺癌腫瘤外泌體，并使用一種新型高敏感度納米顆粒成像技術(shù)——磁粒子成像(magnetic particle imaging，MPI)在體內(nèi)連續(xù)成像顯示了外泌體的生物分布情況，同時(shí)負(fù)載的奧拉帕尼能夠增加細(xì)胞凋亡并減慢腫瘤生長(zhǎng)。

3.放射性核素分子成像:近年來(lái)很多放射性核素分子探針被設(shè)計(jì)用于外泌體體內(nèi)成像，如124I、131I、111In-oxine、99mTc-HMPAO、99mTc-三羰基復(fù)合物等，并通過(guò)單光子發(fā)射體層成像(single-photon emission computed tomography，SPECT)、正電子發(fā)射體層成像(positron emission tomography，PET)等觀察外泌體的體內(nèi)生物分布情況。Hwang等[18]用99mTc-HMPAO標(biāo)記巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體，SPECT/CT成像顯示其在小鼠體內(nèi)多分布于肝臟而腦內(nèi)無(wú)攝取。Faruqu等[19]采用兩種不同方法對(duì)黑素瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體(ExoB16)進(jìn)行放射標(biāo)記，即腔內(nèi)標(biāo)記(111In-tropolone)和膜外標(biāo)記(111In-DTPA-anhydride)，結(jié)果表明膜外標(biāo)記的外泌體具有更好的放射標(biāo)記效率和放射化學(xué)穩(wěn)定性，SPECT/CT成像顯示膜外標(biāo)記的ExoB16主要積聚在荷瘤小鼠的肝臟和脾臟，而腫瘤部位較少。Shi等[20]創(chuàng)新性地使用PET無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)銅-64放射性標(biāo)記聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾的外泌體(64Cu-PEG-Exo)，PEG修飾的外泌體在荷瘤小鼠肝內(nèi)清除率較低而在腫瘤部位大量積累，從而實(shí)現(xiàn)了外泌體成像和腫瘤攝取率定量檢測(cè)。但該方法會(huì)造成輻射損傷，不能清晰顯示解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，限制了其在生物體內(nèi)的單獨(dú)多次應(yīng)用。

4.光聲成像(PA):PA是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型結(jié)構(gòu)和功能成像方式，結(jié)合了光學(xué)成像和超聲成像的優(yōu)點(diǎn)，具有高分辨率和高組織對(duì)比度，突破了光學(xué)成像的深度限制，可實(shí)現(xiàn)活體內(nèi)50mm的深層組織成像。Piao等[21]利用金納米顆粒(GN)標(biāo)記綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)穩(wěn)轉(zhuǎn)的樹突狀細(xì)胞，從穩(wěn)定表達(dá)CD63-RFP融合蛋白的4T1細(xì)胞系中分離純化紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)標(biāo)記的外泌體，并通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡觀察樹突狀細(xì)胞吸收外泌體的全過(guò)程。此外還通過(guò)超聲引導(dǎo)的光聲成像敏感且縱向監(jiān)測(cè)經(jīng)外泌體刺激的樹突狀細(xì)胞向腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的動(dòng)態(tài)活動(dòng)，表明超聲引導(dǎo)的PA是一種簡(jiǎn)單便捷的樹突狀細(xì)胞及其內(nèi)外泌體的無(wú)創(chuàng)追蹤成像方式。作為一種新興技術(shù)，PA的成像參數(shù)如掃描方式、脈沖重復(fù)頻率等尚未形成規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)不同部位、器官的高分辨率實(shí)時(shí)光聲成像仍有巨大挑戰(zhàn)。

5.多模態(tài)成像:多模態(tài)成像結(jié)合不同成像方法的特點(diǎn)，如熒光成像(包括近紅外熒光成像，即near-infrared fluorescence，NIRF)、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)、MRI、PA等，經(jīng)圖像融合獲得更多的成像細(xì)節(jié)，提高成像敏感度，其在外泌體成像中應(yīng)用廣泛。Tayyaba等[22]利用HepG2癌細(xì)胞原位生物合成銀和氧化鐵納米團(tuán)簇(nanoclusters，NCs)，如銀NCs可作為熒光探針，F(xiàn)e3O4NCs可用作CT和MRI造影劑，自組裝的NCs很容易加載到外泌體上，有望用于生物體內(nèi)外泌體多模態(tài)成像。Abello等[23]用釓劑和近紅外染料標(biāo)記間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的外泌體，通過(guò)MRI/NIFR成像獲得其在注入骨肉瘤小鼠體內(nèi)24～48h后的生物分布情況。Piao等[24]構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD63-RFP融合蛋白的三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)細(xì)胞系，分離其產(chǎn)生的外泌體，通過(guò)FLI/PA成像觀察體外條件下和原位TNBC模型中外泌體轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程。Shaikh等[25]在腫瘤組織中原位生物合成銥和氧化鐵NCs，并分離含NCs的腫瘤外泌體，特異且敏感地經(jīng)CT/FLI/MRI多模態(tài)成像實(shí)現(xiàn)腫瘤外泌體的活體示蹤。

四、展 望

針對(duì)外泌體納米尺寸及高度特異性的特點(diǎn)，研發(fā)的示蹤劑可實(shí)現(xiàn)多種分子影像學(xué)方法下外泌體的活體示蹤，有利于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)外泌體在體內(nèi)的生物學(xué)行為，對(duì)于研究外泌體發(fā)揮生物學(xué)功能和臨床作用的基礎(chǔ)機(jī)制具有重要意義，尤其是研究腫瘤外泌體在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、早期診斷、液體活檢、靶向載藥及療效評(píng)估上有著重要價(jià)值。然而目前尚缺乏多層次、多模態(tài)的外泌體成像示蹤劑，例如適用于外泌體超聲成像的示蹤劑尚未出現(xiàn)，這些示蹤劑的研發(fā)始終是研究難點(diǎn)，同樣也是研究熱點(diǎn)。因此未來(lái)開發(fā)一種用于腫瘤外泌體超聲成像的靶向示蹤劑具有巨大潛能，它有望簡(jiǎn)單便捷無(wú)輻射地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活體內(nèi)腫瘤外泌體的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，提高早期診斷的敏感度和特異性，同時(shí)可以通過(guò)監(jiān)測(cè)循環(huán)腫瘤外泌體的分布及數(shù)量動(dòng)態(tài)評(píng)估腫瘤手術(shù)治療、化療、放療以及高強(qiáng)度聚焦超聲治療(HIFU)后的療效。相信隨著外泌體活體示蹤分子影像學(xué)研究的進(jìn)一步發(fā)展，可以為外泌體的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究提供更好的方法，促進(jìn)疾病尤其是腫瘤診療一體化平臺(tái)的構(gòu)建。