楊佳雯 謝雙雙 葉樂(lè)馳

轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)的治療是臨床工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一[1]。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是上皮生長(zhǎng)因子細(xì)胞增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。目前，靶向EGFR的單克隆抗體是治療mCRC的一個(gè)突破[2]。其代表藥物西妥昔單抗，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性阻斷EGFR與其配體EGF等的結(jié)合,阻斷EGFR下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。經(jīng)過(guò)一系列臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，西妥昔單抗治療可以增加晚期患者的手術(shù)機(jī)會(huì)，提高mCRC患者的總生存率，已經(jīng)被成功應(yīng)用于mCRC的治療[3]。

2008年后一系列臨床研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，RAS基因野生型患者從西妥昔單抗治療中獲益更大，這對(duì)傳統(tǒng)治療模式的選擇產(chǎn)生了重要影響，使精準(zhǔn)化個(gè)體治療從愿望走向了現(xiàn)實(shí)[4，5]。然而，臨床上仍有部分RAS野生型CRC患者在接受西妥昔單抗治療時(shí)出現(xiàn)無(wú)效或耐藥[6]?？梢?jiàn)深入研究西妥昔單抗耐藥的機(jī)制，并進(jìn)一步尋找潛在的能有效預(yù)測(cè)靶向治療效果的生物學(xué)標(biāo)志物是十分迫切且有必要的。近年來(lái)研究表明，非編碼RNA通過(guò)多種機(jī)制影響CRC的發(fā)生、發(fā)展，這也有利于找到更多的生物學(xué)標(biāo)志物，為解決西妥昔單抗耐藥提供很好的思路。

一、非編碼RNA的概述

非編碼RNA是指能從基因組上轉(zhuǎn)錄但不能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。根據(jù)長(zhǎng)度，非編碼RNA可分為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(>200nt)、微小非編碼RNA(≤200nt)和環(huán)狀RNA。非編碼RNA在轉(zhuǎn)錄、RNA加工和翻譯水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，且每個(gè)非編碼RNA都具有不同的功能，僅在人類基因組中就可能有10000個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA有待研究，因此可以預(yù)測(cè)，非編碼RNA的數(shù)千種新功能有待被發(fā)現(xiàn)[7]。過(guò)去20年的研究揭示了新類別的非編碼RNA，包括微小RNA(miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)等，所有這些非編碼RNA都具有不同的調(diào)節(jié)功能，有效地反饋到更大的RNA通信網(wǎng)絡(luò)中，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的基本蛋白效應(yīng)器[8]。

二、與西妥昔單抗耐藥相關(guān)的miRNA

miRNA是短的、非編碼的核苷酸序列，其通過(guò)與靶mRNA的3′非編碼區(qū)(3-UTR)中的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[9]。研究證實(shí)，miRNA可通過(guò)APC丟失、PTEN/PI3K途徑失調(diào)和SRC過(guò)表達(dá)觸發(fā)、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)化和進(jìn)展[10]。

1.let-7:let-7家族是人類惡性腫瘤中研究最多的miRNA之一。通常通過(guò)下調(diào)參與控制細(xì)胞周期或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)的癌基因來(lái)充當(dāng)腫瘤抑制因子[11]。KRAS是let-7的既定靶標(biāo)，let-7互補(bǔ)位點(diǎn)6(LCS-6)的單核苷酸多態(tài)性(SPF)，破壞了let-7結(jié)合并上調(diào)了KRAS的表達(dá)[12]。Zhang等[13]對(duì)130例入選西妥昔單抗單藥治療Ⅱ期研究(IMCL-0144)的mCRC患者評(píng)估了KRAS、let-7、LCS-6多態(tài)性的存在，結(jié)果表明KRAS的3′UTR多態(tài)性可以預(yù)測(cè)KRAS野生型mCRC患者西妥昔單抗的反應(yīng)性。Ruzzo等[14]研究分析了let-7a在用西妥昔單抗治療的具有KRAS突變的mCRC患者中的表達(dá)水平，其研究顯示，let-7a的上調(diào)可使具有KRAS突變的患者從抗EGFR治療中獲得生存益處，可能潛在地用于改善西妥昔單抗的耐藥。

2.miRNA-181a: miRNA-181a在CRC中可改變Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，miRNA-181a在CRC中的作用及其預(yù)測(cè)存活和對(duì)靶向EGFR藥物的反應(yīng)能力尚未被探索。Pichler等[15]對(duì)80例接受西妥昔單抗和帕尼單抗治療的KRAS野生型mCRC患者進(jìn)行了分析。研究表明，miRNA-181a在腫瘤組織中的低表達(dá)與KRAS野生mCRC患者中較差的總生存期(OS)和無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)相關(guān)。Kaplan-Meier曲線顯示出miRNA-181a低表達(dá)患者的OS縮短(P=0.019),miRNA-181a低表達(dá)還與不良PFS相關(guān)(P=0.015)。

3.miRNA-345：miRNA-345是所有患者以及非KRAS突變?nèi)巳褐蠴S和PFS的單一預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物。為研究接受西妥昔單抗和伊立替康治療的mCRC患者的總生存率，Schou等[16]在138例接受西妥昔單抗和伊立替康三線治療的mCRC患者中，從全血中分離并分析了738個(gè)預(yù)處理miRNA，其中KRAS、BRAF和PIK3CA是突變狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種miRNA(miRNA-345、miRNA-143、miRNA-34a、miRNA-628-5p、miRNA-886-3p和miRNA-324-3p)與短OS相關(guān)。其中miRNA-345是最強(qiáng)的預(yù)后miRNA，在整個(gè)隊(duì)列和非KRAS突變體群體中均具有重要意義。

4.let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b: 為評(píng)估西妥昔單抗或帕尼單抗治療的兩個(gè)不同的mCRC患者隊(duì)列中的miRNA表達(dá)，并研究miRNA是否可預(yù)測(cè)mCRC患者對(duì)抗EGFR單克隆抗體的敏感度，Cappuzzo等[17]通過(guò)納入來(lái)自2個(gè)獨(dú)立隊(duì)列(隊(duì)列1∶74例，驗(yàn)證隊(duì)列：109例)的西妥昔單抗或帕尼單抗治療的183例mCRC患者，并用分析miRNA序列的方法鑒定了let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b是與抗EGFR治療結(jié)果不同的標(biāo)志。在隊(duì)列1中，具有高let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b表達(dá)的患者的PFS和OS明顯更長(zhǎng)。在驗(yàn)證隊(duì)列中，具有高表達(dá)患者也具有更長(zhǎng)的PFS和OS。在KRAS野生型人群(120例)中，高表達(dá)患者的PFS和OS也明顯更長(zhǎng)。但在KRAS突變患者中比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此，他們得到let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b可改善KRAS野生型mCRC患者的選擇，作為抗EGFR治療的良好候選者的結(jié)論。因此let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b可能在mCRC西妥昔單抗耐藥中發(fā)揮作用，并影響了西妥昔單抗或帕尼妥單抗治療的mCRC患者的PFS和OS。

5.miRNA-31-5p/3p:可能參與調(diào)節(jié)BRAF的活化并在CRC的EGFR下游的信號(hào)通路中發(fā)揮作用。Igarashi等[18]研究分析了102例接受抗EGFR治療的CRC患者在EGFR下游途徑中的miRNA-31-5p表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)表明，在攜帶所有野生型基因的CRC中，高miRNA-31-5p與較短的PFS相關(guān)，表明它可能是抗EGFR治療預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。Mlcochova等[19]在28例為西妥昔單抗治療的RAS野生型mCRC患者和24例為帕尼單抗治療的RAS野生型mCRC患者中鑒定出9種對(duì)西妥昔單抗治療的應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者之間表達(dá)顯著不同的miRNA。進(jìn)一步評(píng)估成功證實(shí)，在用西妥昔單抗治療的患者中高miRNA-31-3p和miRNA-31-5p與低進(jìn)展時(shí)間(TTP)強(qiáng)相關(guān)。他們猜測(cè)miRNA-31-5p/3p可能是RAS野生型mCRC患者西妥昔單抗應(yīng)答的預(yù)測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物。Manceau等[20]則研究認(rèn)為miRNA-31-3p可能是一種新的mCRC生物學(xué)標(biāo)志物，其表達(dá)水平可用于識(shí)別對(duì)抗EGFR治療產(chǎn)生反應(yīng)的KRAS野生型mCRC患者。綜上所述，miRNA-31-5p/3p有希望成為KRAS野生型mCRC患者抗西妥昔單抗應(yīng)答的預(yù)測(cè)性生物學(xué)標(biāo)志物，需要進(jìn)一步研究。

6.miRNA-133b: miRNA-133b可直接靶向EGFR并抑制其在CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平來(lái)抑制CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。Zhou等[21]研究表明，在人CRC組織和細(xì)胞系中miRNA-133b表達(dá)水平下調(diào)。與單獨(dú)治療比較，miRNA-133b模擬物和西妥昔單抗的聯(lián)合治療顯示出更好的抑制大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的效果。他們的研究明確了miRNA-133b/EGFR相互作用在大腸癌細(xì)胞中的作用，提示西妥昔單抗與miRNA-133b聯(lián)合治療大腸癌是積極的，可能是未來(lái)治療大腸癌的一種潛在新療法。

7.miRNA-7: miRNA-7是包括CRC在內(nèi)的所有惡性腫瘤中的腫瘤抑制因子，能有效抑制CRC細(xì)胞的增殖。Suto等[22]研究表明miRNA-7可通過(guò)抑制EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改變西妥昔單抗耐藥的HCT116和SW480細(xì)胞(含有KRAS突變)和HT29細(xì)胞(含有BRAF突變)中的西妥昔單抗敏感度。西妥昔單抗治療不會(huì)降低HCT116和SW480細(xì)胞的增殖，但在miRNA-7前體處理的HCT116和SW480細(xì)胞中，西妥昔單抗的敏感度增加。該研究即使存在KRAS突變，miRNA-7高表達(dá)的原發(fā)性CRC中的西妥昔單抗敏感度也高于miRNA-7低表達(dá)的CRC。因此，miRNA-7可能是CRC中西妥昔單抗耐藥標(biāo)志物。

8. miRNA-375: 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是EGFR的配體，且CTGF在大腸癌組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的正常結(jié)腸組織。Alam等[23]研究證明，miRNA-375的過(guò)表達(dá)通過(guò)降低CTGF表達(dá)調(diào)節(jié)人CRC細(xì)胞和組織中的EGFR信號(hào)通路，來(lái)抑制細(xì)胞存活、增殖、遷移和血管生成。此外miRNA-375過(guò)表達(dá)和西妥昔單抗共同治療的結(jié)果顯示它們協(xié)同增強(qiáng)了CRC細(xì)胞的凋亡和壞死。因此，miRNA-375具有與西妥昔單抗耐藥相關(guān)的治療價(jià)值。

9. MIR100HG衍生的miRNA-100和miRNA-125b: 原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥主要是遺傳改變所導(dǎo)致的，而耐藥則是抗EGFR治療的障礙。Lu等[24]在西妥昔單抗耐藥的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MIR100HG和兩個(gè)衍生的miRNAs(miRNA-100，miRNA-125b)過(guò)表達(dá)。此外，在西妥昔單抗耐藥的CRC以及在西妥昔單抗治療進(jìn)展中的CRC患者的腫瘤中也觀察到MIR100HG、miRNA-100和miRNA-125b的過(guò)表達(dá)。研究人員發(fā)現(xiàn)，miRNA-100和miRNA-125b協(xié)調(diào)抑制著5個(gè)Wnt/β-連環(huán)通路通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子(DKK1、DKK3、ZnFR3、RNF43和APC2)，導(dǎo)致Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加，在西妥昔單抗耐藥細(xì)胞中通過(guò)抑制Wnt可恢復(fù)西妥昔單抗的反應(yīng)性。同時(shí)，研究表明MIR100HG和轉(zhuǎn)錄因子GATA6之間存在雙負(fù)反饋回路，轉(zhuǎn)錄因子GATA6對(duì)MIR100HG具有抑制作用，但是這種抑制被以GATA6為靶點(diǎn)的miRNA-125b所解除。這些發(fā)現(xiàn)確定了西妥昔單抗臨床可行的表觀遺傳因素。

三、與西妥昔單抗耐藥相關(guān)的lncRNA

lncRNA通過(guò)干擾miRNA的活性，直接與蛋白質(zhì)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)它們的活性或改變它們的定位。通過(guò)抑制RNA聚合酶影響下游基因表達(dá)，以及作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)在生物過(guò)程中起重要作用[8]。隨著CRC新型分子和表觀遺傳機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，lncRNA已成為診斷、預(yù)后和治療中應(yīng)用價(jià)值不斷上升的生物學(xué)靶標(biāo)。近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在CRC等腫瘤細(xì)胞的耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

1.LINC00973: Jing等[25]建立了西妥昔單抗耐藥細(xì)胞系(H508/CR)，并進(jìn)行了RNA測(cè)序，驗(yàn)證lncRNA的表達(dá)水平后，對(duì)表達(dá)水平上調(diào)最顯著的lncRNA分子LINC00973進(jìn)行RNA-FISH檢測(cè)。結(jié)果證實(shí)，H508/CR細(xì)胞中LINC00973表達(dá)水平升高。此外，LINC00973抑制作用使葡萄糖消耗和乳酸分泌分別降低。敲低該lncRNA后，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡增加，葡萄糖消耗和乳酸分泌減少，并可以改善H508細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的耐藥性。因此，LINC00973表達(dá)水平可用于預(yù)測(cè)西妥昔單抗耐藥性的預(yù)后。

2.POU5F1P4: Peng等[26]在西妥昔單抗治療的mCRC隊(duì)列中進(jìn)行了lncRNA表達(dá)譜分析。研究發(fā)現(xiàn)9種lncRNA差異表達(dá)，其中有5種與患者的PFS顯著相關(guān)。在這5個(gè)lncRNA中，POU5F1P4在獲得性西妥昔單抗耐藥細(xì)胞以及西妥昔單抗耐藥患者中均下調(diào)。他們對(duì)POU5F1P4共表達(dá)的蛋白編碼基因進(jìn)行了研究。9個(gè)POU5F1P4共表達(dá)基因(AREG、CKB、ERG、MYC、NOX1、SLC39A2、ANO1、CYP3A5和NT5E)在疾病對(duì)照組和無(wú)應(yīng)答組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并發(fā)現(xiàn)共表達(dá)的基因在EGFR結(jié)合上顯著富集。證明POU5F1P4的下調(diào)降低了CRC細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的敏感度。實(shí)驗(yàn)表明了lncRNA在西妥昔單抗耐藥中的潛在作用，并可能為發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶標(biāo)提供有用的信息。

3.UCA1: 尿路上皮癌相關(guān)1(UCA1)是一種具有3個(gè)外顯子的lncRNA。Yang等[27]研究發(fā)現(xiàn)西妥昔單抗耐藥細(xì)胞及其外顯體中UCA1水平的上調(diào)。他們從西妥昔單抗敏感的Caco-2細(xì)胞中培養(yǎng)出西妥昔單抗耐藥細(xì)胞株Caco2-CR，并用檢測(cè)UCA1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示Caco2-CR細(xì)胞中UCA1的表達(dá)明顯高于Caco-2細(xì)胞。此外，他們檢測(cè)了Caco2-CR細(xì)胞(CR-exo)和Caco2-CS細(xì)胞(CS-exo)來(lái)源的外顯體中UCA1的水平，發(fā)現(xiàn)CR-exo中的UCA1水平明顯高于CS-exo，表明UCA1主要集中在Caco 2-CR細(xì)胞來(lái)源的外顯體中，而且UCA1的表達(dá)可能與西妥昔單抗耐藥有關(guān)。

四、環(huán)狀RNA

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類非編碼RNA，數(shù)以千計(jì)的內(nèi)源性circRNA存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，它們通過(guò)與miRNA或其他分子結(jié)合，然后抑制其功能，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后的水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而影響腫瘤發(fā)生和癌癥通路的調(diào)節(jié)?；赾ircRNA在癌癥中的功能，Qu等[28]和Zhang等[29]研究認(rèn)為circRNA有希望作為診斷腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物。Hansen等[30]在人和小鼠腦中發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)的circRNA,證明了circRNA可充當(dāng)miRNA-7海綿，稱此為miRNA-7的環(huán)狀RNA海綿(ciRS-7)。CiRS-7含有70多個(gè)選擇性保守的miRNA靶位點(diǎn)，并且以miRNA-7依賴性方式與Argonaute(AGO)蛋白高度相關(guān)。盡管circRNA對(duì)miRNA介導(dǎo)的靶向去穩(wěn)定化具有完全抗性，但它強(qiáng)烈抑制miRNA-7活性，導(dǎo)致miRNA-7靶標(biāo)水平增加。而miRNA-7是包括CRC在內(nèi)的所有惡性腫瘤中的腫瘤抑制因子，能有效抑制CRC細(xì)胞的增殖，且miRNA-7在CRC中可能存在西妥昔單抗耐藥標(biāo)志物，所以ciRS-7可能會(huì)成為CRC中有效的西妥昔單抗耐藥標(biāo)志物。

五、展 望

綜上所述，非編碼RNA特別是lncRNA、miRNA及circRNA在西妥昔單抗的耐藥機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，對(duì)包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的惡性腫瘤的治療具有深遠(yuǎn)意義。lncRNA、miRNA及circRNA均可通過(guò)介導(dǎo)EGFR信號(hào)通路調(diào)節(jié)西妥昔單抗的敏感度，此外，lncRNA還可通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝及Wnt信號(hào)通路導(dǎo)致西妥昔單抗耐藥。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，會(huì)有越來(lái)越多的與結(jié)直腸癌中西妥昔單抗耐藥相關(guān)的新非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)。目前對(duì)非編碼RNA的研究也正處于初步階段，其具體調(diào)控的機(jī)制，需要進(jìn)一步探索。