孟天偉 常 虹

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150036；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040）

急性心肌梗死（AMI）是以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化為主要機(jī)制，在此基礎(chǔ)上，由于內(nèi)膜損傷、血流變緩、血小板沉積等因素引起血栓形成，心肌供血進(jìn)一步減少甚至中斷，使心肌嚴(yán)重而持久地急性缺血，即發(fā)生心肌梗死［1］。另外，心肌耗氧量增加或冠狀動(dòng)脈痙攣也是誘發(fā) AMI的條件因素［2］。AMI屬于中醫(yī)“真心痛”“厥心痛”的范疇，《靈樞·厥病》有云“真心痛，手足清至節(jié)，心痛甚，旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死”。由此可見該病具有病情重，病勢(shì)急的特點(diǎn)。經(jīng)過歷代醫(yī)家總結(jié)發(fā)現(xiàn)本病為本虛標(biāo)實(shí)證，本虛主要是以氣虛、陽(yáng)虛、陰虛為主，其中心氣虛、心陰虛最為常見。標(biāo)實(shí)主要有血瘀、氣滯、痰濕、寒凝，其中血瘀為該病最主要的病理特點(diǎn)，且常常夾雜于其他實(shí)邪之中。心陽(yáng)虧虛，痰濁阻絡(luò)引發(fā)心痛也是臨床常見的一類癥型［3］。

復(fù)方丹參滴丸是由丹參、三七、冰片3種藥材經(jīng)過現(xiàn)代工藝特殊加工制成的丸劑型中成藥，具有活血化瘀，理氣止痛的作用，對(duì)于氣滯血瘀型冠心病，胸悶、心前區(qū)刺痛的心絞痛或心肌梗死患者具有較好的療效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，復(fù)方丹參滴丸具有抗鈣超載、抗炎、抗氧化、抑制血栓形成等作用。任宏強(qiáng)等［4］發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參滴丸可通過降低AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平來抑制AMI細(xì)胞凋亡。李建等［5］發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸能抑制AMI患者左心室重構(gòu)，且副作用小。復(fù)方丹參滴丸是第一例通過美國(guó)認(rèn)證的復(fù)方中成藥，在其治療AMI的眾多研究中，更多的是對(duì)于復(fù)方丹參滴丸治療AMI的單靶點(diǎn)、單通路的作用機(jī)制的相關(guān)研究。本次研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建藥物、靶點(diǎn)以及相關(guān)通路的網(wǎng)絡(luò)圖，將可能治療疾病的相關(guān)靶點(diǎn)和通路展示，為后續(xù)的研究提供參考和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 復(fù)方丹參滴丸化學(xué)成分的獲取及相關(guān)靶點(diǎn)篩選在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)TCMSP（https：//tc?mspw.com/tcmsp.php）以復(fù)方丹參滴丸中主要成分丹參、三七、冰片的名稱為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取復(fù)方丹參滴丸中各化合物的相關(guān)信息。并以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，半衰期（HL）≥4 h作為篩選指標(biāo)，篩選出符合條件的有效成分。再通過Swiss Target Prediction［6］（http：//www.Swisstargetprediction.ch/）查找單個(gè)成分作用的靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)輸入至UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，校正基因名稱。

1.2 急性心肌梗死相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以“Acute myocar?dial infarction”為關(guān)鍵詞通過DisGENET數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.disgenet.org/）以及 DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.drugbank.ca/）檢索疾病靶點(diǎn)，選取基因和疾病的相關(guān)性平均值以上的靶點(diǎn)，以保證此次研究的準(zhǔn)確性。

1.3 復(fù)方丹參滴丸治療急性心肌梗死的核心靶點(diǎn)篩選將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)映射獲得相關(guān)治療靶點(diǎn)，并將這些靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）獲得蛋白互作信息，篩選閾值高于0.900的高置信度互作信息。使用Cytoscape3.8.0［7］軟件構(gòu)建復(fù)方丹參滴丸與AMI疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并通過軟件中的Network Ana?lyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯Y選節(jié)點(diǎn)自由度大于平均值的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 使用Omicshare（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）平臺(tái)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO二級(jí)分類富集分析，物種選擇“智人”運(yùn)行獲得生物過程，分子功能，細(xì)胞成分分析結(jié)果。利用DAVID平臺(tái)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因組百科全書KEGG（kyoto encyclope?dia of genes and genomes）通路分析，篩選P值<0.01，頻次在10次或10次以上的條目，認(rèn)為這些通路在復(fù)方丹參滴丸治療AMI的過程中起到重要作用，以此來獲得顯著性較高的分析結(jié)果。

1.5 “化合物有效成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.8.0軟件對(duì)復(fù)方丹參滴丸化合物有效成分、核心靶點(diǎn)與通路之間的關(guān)系進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“化合物有效成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理圖，以便于后續(xù)的分析研究。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方丹參滴丸化合物、活性成分及潛在靶點(diǎn)的收集與篩選 通過TCMSP篩選獲得符合條件的丹參的化合物40個(gè)，三七的化合物7個(gè)，冰片的化合物3個(gè)。獲得靶點(diǎn)1 965個(gè)，篩除重復(fù)后共獲得靶點(diǎn)445個(gè)。將復(fù)方丹參滴丸中的50個(gè)化學(xué)成分以藥物名稱拼音加代號(hào)的方式代替，以便后續(xù)構(gòu)圖。對(duì)應(yīng)列表如表1所示。

表1 復(fù)方丹參滴丸化合物成分匯總表

續(xù)表1-1

2.2 AMI靶點(diǎn)的篩選 通過DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到疾病靶點(diǎn)數(shù)量為34個(gè)，DisGENET數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到疾病靶點(diǎn)數(shù)量為766個(gè)，以基因和疾病的相關(guān)性（Score_gda）的平均值為篩選標(biāo)準(zhǔn)，選擇數(shù)值在0.0213以上的靶點(diǎn)共151個(gè)，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得靶點(diǎn)185個(gè)，篩除重復(fù)靶點(diǎn)后最終獲得靶點(diǎn)數(shù)量159個(gè)。

2.3 復(fù)方丹參滴丸治療AMI的核心靶點(diǎn)篩選 將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)映射后獲得治療靶點(diǎn)61個(gè)，通過“1.3項(xiàng)”的方法，獲得靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖1，運(yùn)用Cytoscape3.8.0構(gòu)建“藥物成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。通過拓?fù)浞治龊Y選出自由度大于平均值8.018的靶點(diǎn)24個(gè)，認(rèn)為這些靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，結(jié)果如表2所示，并構(gòu)建“有效成分-疾病靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示。在網(wǎng)絡(luò)中，某個(gè)節(jié)點(diǎn)的自由度代表在本網(wǎng)絡(luò)中該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)相互作用的數(shù)目，若自由度的值越大，則證明該節(jié)點(diǎn)的重要性越高，其中羧酸酯酶1（CES1）的自由度為23，是本網(wǎng)絡(luò)中度值最大的靶點(diǎn)，因此復(fù)方丹參滴丸治療AMI的過程中，該靶點(diǎn)起到關(guān)鍵作用。

表2 核心靶點(diǎn)

圖1 復(fù)方丹參滴丸治療AMI靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 “復(fù)方丹參滴丸-有效成分-疾病名稱-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 “有效成分-疾病靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO富集分析與KEGG通路富集分析結(jié)果 復(fù)方丹參滴丸治療AMI的GO富集分析如圖4～圖5所示。由圖可知，這些核心靶點(diǎn)可以通過細(xì)胞的生物過程，細(xì)胞的代謝過程，細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)等方面影響生物過程；通過離子結(jié)合、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)劑等方面影響分子功能；通過細(xì)胞器、細(xì)胞膜、細(xì)胞膜部件、細(xì)胞外區(qū)等方面影響細(xì)胞組成。以P值<0.01，頻次在10次或10次以上的條目為篩選條件，共篩選出復(fù)方丹參滴丸治療AMI的KEGG通路富集分析25條，結(jié)果如表3所示。從表3可知，復(fù)方丹參滴丸治療AMI可能與多種通路相關(guān)，可能通過調(diào)節(jié)癌癥的途徑、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等相關(guān)。利用Cytoscape對(duì)藥物有效成分、核心靶點(diǎn)與通路之間的關(guān)系進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“化合物有效成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理圖，如圖5所示。在各通路中癌癥通路自由度最大為21，該通路可能是復(fù)方丹參滴丸治療AMI的關(guān)鍵通路。

表3 復(fù)方丹參滴丸治療AMI的KEGG通路富集分析

圖4 復(fù)方丹參滴丸治療AMI的GO富集分析柱狀圖

圖5 復(fù)方丹參滴丸治療AMI的GO富集分析氣泡圖

3 討 論

本次研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸通過丹參酮、積雪草酸、槲皮素等50種化合物共同作用于MAPK8、CASP3、CES1等24個(gè)核心靶點(diǎn)，并通過調(diào)節(jié)癌癥的途徑、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等發(fā)揮治療AMI的作用。

丹參作用于AMI的有效化合物成分主要是酮類，丹參酮ⅡA具有降低AMI后心律失常的發(fā)生率、擴(kuò)張血管的作用，從而降低心梗死亡率。單宏麗等［8］發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA通過MAPK信號(hào)通路和SRF信號(hào)通路抑制miR-1從而改善心肌離子通道失衡，保護(hù)心肌。三七主要通過槲皮素等化合物，發(fā)揮著抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。唐玉等［9］發(fā)現(xiàn)槲皮素通過抑制細(xì)胞間黏附分子表達(dá)，保護(hù)AMI患者的心肌。積雪草酸為冰片治療AMI的主要化合物。史艷霞等［10］發(fā)現(xiàn)積雪草酸通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1以及NF-κB來改善AMI大鼠的心肌損傷；榮霞等［11］發(fā)現(xiàn)積雪草酸抑制SIRT3/β-catenin/PPARγ信號(hào)通路可以對(duì)AMI大鼠的心肌組織起到一定的保護(hù)作用。MAPK8基因是MAP激酶家族中的一員。MAP激酶參與多種細(xì)胞過程如增殖、分化和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。該激酶激活多種細(xì)胞刺激和目標(biāo)特定的轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)即早期基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞刺激的反應(yīng)。有研究表明，MAP激酶對(duì)于T細(xì)胞的增殖、凋亡和分化發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CASP3（半胱天冬酶3）在細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用，而細(xì)胞凋亡的失敗是癌癥的重要標(biāo)志之一［12］。CES1是CES（羧酸酯酶）家族中的一員，CES屬于藥物代謝酶的第一階段，該家族可以水解各種藥物酯、酰胺、氨基甲酸酯和類似結(jié)構(gòu)［13］。有學(xué)者［14］發(fā)現(xiàn)，一些功能CES1基因變異的（例如G143E）可能損害血管緊張素的激活，從而影響血管緊張素高活性化合物的治療結(jié)果。

圖6 化合物有效成分-靶點(diǎn)-通路

癌癥通路涉及血管生成、細(xì)胞增殖等過程。癌癥主要是由基因改變引起的，因?yàn)榛蚋淖儗?dǎo)致維持細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)紊亂。多數(shù)癌癥是由各種環(huán)境因素造成的體細(xì)胞突變和生殖細(xì)胞突變共同作用引起的。然而，多數(shù)突變位于基因組位置上缺乏蛋白編碼能力的區(qū)域，其中包括以RNA分子發(fā)揮功能的基因區(qū)［15］。HIF-1信號(hào)通路在多種心血管疾病、炎癥等過程中發(fā)揮重要作用。HIF-1蛋白是缺氧狀態(tài)下調(diào)控血管新生的重要分子［16-17］，HIF-1作為內(nèi)源性保護(hù)分子在缺血缺氧性腦血管疾病、急性心肌梗死等疾病中對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的存活和心肌細(xì)胞的再生具有重要意義。萬(wàn)俊等［18］發(fā)現(xiàn)HIF-1α反義寡核苷酸對(duì)BMMSCs治療AMI具有抑制作用，BMMSCs對(duì)大鼠AMI的部分治療作用可能是通過HIF-1α介導(dǎo)的。TNF家族目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30多種細(xì)胞因子，研究表明TNF具有殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞、提高中心粒細(xì)胞的吞噬抗感染等生物學(xué)活性，因此，TNF不僅是一種可引起腫瘤壞死的循環(huán)因子，同時(shí)也可被確定為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子。血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)TNF因子的反應(yīng)是經(jīng)歷一系列促炎性改變，增加白細(xì)胞黏附、跨內(nèi)皮遷移和血管滲漏，促進(jìn)血栓形成［19］。

綜上所述，本次研究充分證明復(fù)方丹參滴丸可以通過多個(gè)藥物化合物成分作用于多個(gè)AMI靶點(diǎn)，再對(duì)有效靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析后發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸通過癌癥的途徑、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等多條通路對(duì)AMI進(jìn)行治療和調(diào)控?，F(xiàn)階段對(duì)于復(fù)方丹參滴丸治療AMI的通路研究并不全面，而有些相關(guān)通路如：癌癥的途徑、TNF信號(hào)通路等并未被提及或研究。此次研究不僅佐證了前期對(duì)復(fù)方丹參滴丸治療AMI的研究結(jié)論，同時(shí)研究出新的治療AMI的靶點(diǎn)方向與相關(guān)通路，為后續(xù)的研究提供新的思路和方向。