宋欠紅 樊 睿 李 易 葉 勇 柳 堯 何昕徽 趙 淳△

（1.云南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，云南 昆明 650500；2.云南省昆明市中醫(yī)院，云南 昆明650500）

血脂異常主要包括血漿總膽固醇（TC）、三酰甘油（TAG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）代謝異常。TC、TAG、LDL-C升高和（或）HDL-C降低為常見類型。血脂異常是多種心腦血管疾病如動脈粥樣硬化、腦血管意外、高血壓、冠心病等的獨立危險因素［1］。我國高脂血癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為危害健康的重要因素［2］。

芪蛭通脈顆粒是云南省榮譽名中醫(yī)、云南中醫(yī)藥大學終身教授趙淳教授經(jīng)驗方。運用該方治療血脂異常取得較好的臨床療效，前期臨床研究發(fā)現(xiàn)該方對血脂異?；颊逿C、TG、LDL-C、HDL-C調(diào)控作用明顯。本實驗是通過觀察芪蛭通脈顆粒對冠心病大鼠血脂異常的調(diào)節(jié)作用及前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PC?SK9）/低密度脂蛋白受體（LDLR）信號通路相關(guān)蛋白及血管細胞間黏附分子1（VCAM-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的調(diào)控，探討其對血脂異常的作用機制［3-5］?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康SPF級Wistar大鼠60只，體質(zhì)量220～260 g，由昆明醫(yī)科大學動物中心生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇）2018-0003，大鼠合格證號：430067000017126。實驗前1周在實驗環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進食、飲水。飼養(yǎng)溫度（20±2）℃，濕度：30%～70%。

1.2 實驗藥物 自擬方芪蛭通脈顆粒（由炙黃芪20 g，水蛭粉3 g，三七6 g，紅曲6 g，燈盞細辛15 g組成），由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)（批號：2008029）。阿托伐他汀鈣片，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)（規(guī)格：20 mg/片，批號：ED02825）。

1.3 試劑與儀器 BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔源PCSK9抗體購自美國Cell signaling technology公司；兔源LDLR抗體購自美國Cell signaling technology公司；兔抗鼠VCAM-1單克隆抗體購自美國abeam公司；兔抗鼠ICAM-1單克隆抗體購自美國santa-cmze公司。TAG、TC、HDL-C、LDL-C檢測試劑盒購自星漢科技公司。電子分析天平由德國sartorius公司生產(chǎn)；凝膠成像設(shè)備由美國BIO-RAD公司生產(chǎn)。

1.4 造模與分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為6組，每組10只，分別為：空白對照組、模型組、阿托伐他汀組以及芪蛭通脈顆粒高、中、低劑量組。在張文立等［6-7］報道方法的基礎(chǔ)上進行改良，復制大鼠冠心病模型。除空白對照組外，其余各組均喂飼高脂飼料（10%豬油，2%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶，87.3%基礎(chǔ)飼料）8周，每日灌胃1次，按5 mL/kg液體量灌胃，空白對照組給予等量蒸餾水灌胃。第8周第4日開始，空白對照組繼續(xù)給予等量蒸餾水灌胃。其余組給予垂體后葉素腹腔注射，按每次30 U/kg，每日1次，連續(xù)給藥3 d。第3日注射后30 min內(nèi)描記心電圖，若滿足ST段抬高超過0.1 mV，T波高聳，心律不齊，則視為造模成功。

1.5 干預方法 實驗組于第9周開始灌藥，連續(xù)治療4周。實驗動物與成人用藥量的換算方法參考文獻［8］，阿托伐他汀鈣組給予阿托伐他汀鈣水溶液灌胃（按10 mg/mL水溶液，13 mg/kg體質(zhì)量給藥）；芪蛭通脈低、中、高劑量組予以芪蛭通脈藥液1、2、4倍給藥（按1 g/mL水溶液，6.5 g/kg為低劑量，13 g/kg為中劑量，26 g/kg為高劑量給藥）。空白對照組與模型組灌胃等劑量生理鹽水。

1.6 觀察指標 12周實驗結(jié)束后，將動物分別稱重，按體質(zhì)量予以5 mL/kg腹腔內(nèi)注入10%水合氯醛麻醉。待麻醉生效后，將大鼠仰臥位固定四肢，碘伏消毒皮膚，切開胸腹壁組織，暴露主動脈，在腹主動脈處5號采血針采血5 mL，室溫2 000 r/min離心20 min后，取上清液即血清分裝于ependor管置于-20℃冰箱。1）檢測血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C，嚴格按照試劑說明書進行檢測。2）Western blotting法檢測PCSK9、LDLR、VCAM-1和ICAM-1等蛋白水平。打開腹腔，清除淤血，取出肝臟組織，用眼科剪剪碎，放置于10 mL離心管中，加入裂解液，勻漿器勻漿，使其充分裂解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心15 min，溫度4℃，取上清液，-80℃環(huán)境中保存；按BCA說明書蛋白定量測定，根據(jù)蛋白分子量配置合適濃度的分離膠與濃縮膠，連接好電泳設(shè)備，將電壓調(diào)制80 V電泳，預染Marker分離出紅色條帶后，將電壓調(diào)到120 V恒定。加入轉(zhuǎn)膜液，轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后孵育一抗，洗膜，孵育二抗，顯色，得出待測蛋白的條帶，用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶后進行光密度分析。

1.7 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。各組數(shù)據(jù)以（±s）表示，運用方差分析進行統(tǒng)計學處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較 見表1。與空白對照組比較，模型組大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組和芪蛭通脈低、中、高劑量組大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平均降低（P<0.05）；阿托伐他汀組和芪蛭通脈低、中、高劑量組大鼠血清HDL-C水平均較模型組升高（P<0.05）；芪蛭通脈低、中、高劑量組大鼠血清HDL-C水平與阿托伐他汀組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平與阿托伐他汀組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組大鼠血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較（mmol/L，±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與阿托伐他汀組比較，△P<0.05。下同。

組別空白對照組模型組阿托伐他汀組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 10 10 10 10 10 TAG 0.81±0.04**2.76±0.32 1.05±0.22 1.93±0.27*△1.31±0.30*1.23±0.29*TC 3.55±0.68**9.31±1.23 5.17±0.88 6.58±1.01*△6.33±1.05*5.89±0.97*HDL-C 1.92±0.23**0.65±0.05 1.28±0.15 1.22±0.21*1.31±0.24*1.35±0.16*LDL-C 1.87±0.21**5.81±0.73 3.03±0.36 3.63±0.44*△3.55±0.55*3.82±0.56*

2.2 各組大鼠肝臟PCSK9、LDLR表達水平 見圖1，表2。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠肝臟PCSK9水平上調(diào)（P<0.01），LDLR表達水平下調(diào)（P<0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組、芪蛭通脈中、高劑量組PCSK9水平下調(diào)（P<0.05）；與模型組比較，阿托伐他汀組、芪蛭通脈低、高劑量組LDLR水平上調(diào)（P<0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組與阿托伐他汀組比較，在PCSK9方面差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；芪蛭通脈低劑量組與阿托伐他汀組比較，在PCSK9方面有明顯差異（P<0.05），芪蛭通脈低、高劑量組與阿托伐他汀組比較，在LDLR方面無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；芪蛭通脈中劑量組與阿托伐他汀組比較，在LDLR方面有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

圖1 各組大鼠肝臟PCSK9、LDLR表達水平

表2 各組大鼠肝臟PCSK9、LDLR相對表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠肝臟PCSK9、LDLR相對表達水平比較（±s）

組別空白對照組模型組阿托伐他汀組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 10 10 10 10 10 PCSK9 0.60±0.15**1.53±0.22 0.89±0.16*1.24±0.31△0.91±0.17*0.79±0.21*LDLR 0.69±0.15**0.41±0.05 0.68±0.09*0.58±0.10*0.52±0.09△0.62±0.12*

2.3 各組大鼠肝臟VCAM-1和ICAM-1表達水平 見圖2，表3。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠肝臟VCAM-1、ICAM-1水平上調(diào)（P<0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組、芪蛭通脈中、高劑量組VCAM-1和ICAM-1水平下調(diào)（P<0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組與阿托伐他汀組比較，在VCAM-1、ICAM-1方面無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；芪蛭通脈低劑量組與阿托伐他汀組比較，在VCAM-1、ICAM-1方面差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖2 各組大鼠肝臟VCAM-1和ICAM-1表達水平

表3 各組大鼠肝臟VCAM-1和ICAM-1相對表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠肝臟VCAM-1和ICAM-1相對表達水平比較（±s）

images/BZ_47_1248_1602_2252_1664.png空白對照組模型組阿托伐他汀組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組10 10 10 10 10 10 0.43±0.08**0.91±0.26 0.66±0.11 0.91±0.18△0.78±0.14*0.74±0.21*1.02±0.17**1.66±0.36 1.13±0.22 1.31±0.26△1.19±0.24*1.11±0.16*

3 討論

高脂血癥是動脈粥樣硬化的首要危險因素，臨床常用的治療藥物有他汀類、貝特類、膽固醇吸收抑制劑、煙酸等。但長期用藥特別是他汀類會引起谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶升高，出現(xiàn)肌痛、肌炎、橫紋肌溶解、頭痛、失眠、抑郁及消化不良等不良反應(yīng)［9］。

本文通信作者趙淳教授認為高脂血癥的發(fā)生發(fā)展是由于飲食不節(jié)、過食肥甘和（或）由于正虛，脾肝腎三臟功能失調(diào)（體內(nèi)脂“糖”代謝紊亂，這里糖為廣義的糖，包括單糖、雙糖、多糖），致氣血不歸正化，而產(chǎn)生痰瘀，并互結(jié)為患，又加重脾肝腎功能失調(diào)，互為因果，形成惡性循環(huán)。其主要治法是益氣活血、健脾化痰、化瘀通絡(luò)。冠心病屬中醫(yī)學“胸痹心痛”病范疇，歷代醫(yī)家重視“陽微陰弦”理論。趙淳教授結(jié)合現(xiàn)代氣候、環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)、工作生活方式、體質(zhì)等的變化，認為諸邪化熱、熱毒致瘀、瘀阻心絡(luò)是冠心病的主要病機之一?；颊唧w內(nèi)的肥甘、膏脂形成痰毒、瘀毒等蓄積蘊結(jié)，變生熱毒，敗壞形體、損傷心與心絡(luò)，導致胸痹心痛的各種病理演變。芪蛭通脈顆粒即是在該理論的指導下，結(jié)合民族醫(yī)藥經(jīng)驗創(chuàng)制的治療高脂血癥、動脈粥樣硬化性心腦血管病患者安全有效的驗方。芪蛭通脈顆粒由炙黃芪、水蛭粉、三七、紅曲、燈盞細辛組成。方中君藥黃芪益氣補中，補益胸中大氣，臣藥水蛭破血通經(jīng)，逐瘀消瘕，含有抗血栓作用活性物，三七活血化瘀、消腫定痛。佐藥紅曲健脾消食，活血化痰。使藥燈盞細辛有活血通絡(luò)止痛，祛風散寒之功效。全方具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，本方中黃芪可增強體液免疫功能，增強細胞免疫功能，改善心功能，具有調(diào)節(jié)血糖，抗衰老作用；水蛭有抗凝血，直接抑制凝血酶，促纖溶，改善血流變學，抗血栓形成，溶栓，抗血小板聚集，降低血液黏度，調(diào)節(jié)血脂，穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化斑塊，增加心肌營養(yǎng)血流量，改善局部血液循環(huán)等綜合抗凝、抗栓作用；三七有散瘀止血、消腫定痛、抗血栓、促進造血、擴血管、降血壓、抗心肌缺血、抗腦缺血、抗心律失常、抗動脈粥樣硬化等作用；紅曲是細胞自身產(chǎn)生的天然氧化劑，能抑制線粒體的過氧化，有保護生物膜結(jié)構(gòu)完整性的功能，可降低內(nèi)源性膽固醇，加速膽固醇代謝，調(diào)節(jié)載脂蛋白質(zhì)，保護改善血管內(nèi)皮功能，改善心肌重構(gòu)，改善心肌舒縮功能，有利尿、提高免疫功能、抗腫瘤、增強心肌收縮力等作用；燈盞細辛有改善血液流變學作用，防治心肌梗死后再灌注損傷，改善腦缺血，微血管內(nèi)皮細胞保護。

LDL-R是LDL主要的受體，是肝臟組織表達最為豐富的膜糖蛋白，介導了肝臟細胞對脂蛋白的代謝和攝取，在脂蛋白代謝中具有十分重要的意義，是脂蛋白代謝的重要干預靶點，是調(diào)節(jié)機體血脂水平的重要因素［10-11］。肝臟是發(fā)生受體介導的LDL-C清除的主要場所［12］。PCSK9能夠使血清中使血漿中LDL-C水平升高是基于其與LDLR結(jié)合，形成復合物，導致LDLR降解。PCSK9抑制劑可阻止LDLR降解，促進LDL-C的清除，目前市場上PCSK9抑制劑主要為PCSK9單克隆抗體。VCAM-1和ICAM-1是導致動脈粥樣硬化進展的一種重要糖蛋白，容易引起單核細胞和內(nèi)皮細胞發(fā)生黏附，進入內(nèi)皮，分化成為巨噬細胞、泡沫細胞，最終導致動脈粥樣斑塊形成［13-14］。VCAM-1、ICAM-1過度表達與冠心病密切相關(guān)，VCAM-1促進炎癥細胞與血管平滑肌細胞產(chǎn)生黏附，ICAM-1促使炎癥細胞黏附于血管表面［15-16］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，芪蛭通脈顆粒低、中、高劑量組能夠下調(diào)冠心病血脂異常，大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平，升高血清HDL-C水平，表明芪蛭通脈顆粒有一定的調(diào)脂作用。芪蛭通脈顆粒可下調(diào)PCSK9、VCAM-1和ICAM-1表達，上調(diào)LDLR表達，表明其調(diào)脂作用可能是通過調(diào)控PCSK9/LDLR、VCAM-1/ICAM-1信號通路相關(guān)蛋白表達實現(xiàn)的，這為冠心病血脂異常的藥物開發(fā)提供了一定的動物實驗基礎(chǔ)。