葉月華 韋 瑋 巫繁菁△

（1.廣西壯族自治區(qū)醫(yī)療器械檢測中心，廣西 南寧 530031；2.廣西骨傷醫(yī)院，廣西 南寧530012）

急性閉合性軟組織損傷在中醫(yī)中被稱為“傷筋”，屬于急性血瘀證的范疇［1］；現(xiàn)代醫(yī)學認為急性閉合性軟組織損傷是創(chuàng)傷引起的無菌性炎癥［2］。急性閉合性軟組織損傷一般表現(xiàn)為瘀斑、局部疼痛腫脹、功能障礙等，從而影響患者的正常生活。五味消痛酊是廣西骨傷醫(yī)院的自制劑，由五味藤、蘇木、山香、桂枝、當歸尾、荊芥、紫草、重樓、三七共9種藥物組成，具有舒筋活絡、消腫止痛的作用，在臨床上常用于跌打損傷、軟組織腫痛以及運動后的肌肉關節(jié)酸痛。本實驗通過建立急性閉合性軟組織損傷模型大鼠，觀察五味消痛酊對于急性閉合性軟組織損傷以及鎮(zhèn)痛、抗炎的作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠32只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)級別為SPF級，保證正常光照節(jié)律、環(huán)境安靜、溫度適宜，正常大鼠生長繁殖飼料飼養(yǎng)，自由進食和飲水。

1.2 藥物與試劑 五味消痛酊（由廣西骨傷醫(yī)院制備，組成：五味藤、蘇木、山香、桂枝、歸尾、荊芥、紫草、重樓、三七；每100 mL含生藥20 g）；扶他林軟膏（北京諾華制藥有限公司，國藥準字H19990291）；PGE-2試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：12/2020）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：12/2020）；白細胞介素-1β（IL-1β）（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：12/2020）；白細胞介素-6（IL-6）（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：12/2020）

1.3 儀器 全自動血液黏度動態(tài)分析儀South990JK（武漢醫(yī)盾醫(yī)療器械有限公司）；Von frey測痛纖絲（美國North Coast公司）；酶標儀Multiskan FC（賽默飛世爾儀器有限公司）

1.4 模型制備 在造模前1 d以10%硫化鈉將大鼠右后肢小腿進行脫毛處理。造模當天將大鼠固定在軟組織打擊器上，在右后肢小腿中部外側(cè)軟組織標記定位，將100 g打擊錘拉至10 cm高度，打擊標定位置共10次［3］。打擊后明顯可見打擊部位紅腫、淤血，提示造模成功?？瞻捉M進行脫毛處理但不打擊造模。

1.5 分組及給藥 將大鼠分為模型對照組、空白對照組、五味消痛酊組、扶他林軟膏（陽性對照）組。五味消痛酊組按1 mL/kg給藥，每日3次，為彌補藥物持續(xù)時間短的問題，直接涂抹于患處并覆蓋，用紗布與膠布包扎。扶他林軟膏組按1 g/kg給藥，每日3次，直接涂抹于患處并覆蓋，用紗布與膠布包扎。造模當天開始給藥，連續(xù)給藥7 d。

1.6 標本采集與檢測 1）損傷癥狀指數(shù)。分別在給藥的第1、3、5、7天觀察大鼠造模肢體的淤血程度、腫脹程度以及活動情況表現(xiàn)并分級評分。（1）淤血程度：患處暗紫色計2分，暗紅色計1分，色澤正常計0分；（2）腫脹程度：腫脹明顯計2分，稍有腫脹計1分，無腫脹計0分；（3）活動程度：造模肢體不能行動計2分，造模肢體行動力差計1分，造模肢體行動力正常計0分。2）疼痛縮足反射閾值（PWT）。分別在給藥的第1、3、5、7天將大鼠放入底部為金屬篩網(wǎng)的玻璃籠中適應5 min，用Von Frey纖毛機械刺激針垂直刺激大鼠造模后肢的足底部中央皮膚，使纖毛機械刺激針彎曲至大鼠出現(xiàn)縮足反應，若未出現(xiàn)縮足反應則換更大強度的纖毛機械刺激針。從2 g強度開始刺激，上限為16 g；每隔15 s刺激1次，每個強度刺激5次出現(xiàn)3次縮足反應時的最小纖毛機械刺激針強度即為PWT［4］。3）血液流變學指標。在第7天末次給藥后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/mL）進行麻醉，腹主動脈取血，肝素抗凝，用全自動血黏度分析儀檢測大鼠全血高切（150/s）、中切（60/s）、低切（10/s）黏度、血漿黏度和血細胞比容（HCT）。4）損傷組織中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平。取100 mg損傷組織，用PBS洗去血后剪成小塊放入組織研磨器中，加入1 mL PBS制成勻漿，反復凍融2次破壞細胞膜后，將組織勻漿于4℃，5 000 r/min離心15 min。按照ELISA試劑盒說明書操作測定損傷組織中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS26.00統(tǒng)計軟件。服從正態(tài)分布則兩兩比較采用LSD檢驗，若不符合則用秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。圖表采用Graph?pad Prism 5軟件生成。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠損傷癥狀指數(shù)的比較 見表1。在給藥的第1、3、5、7天觀察大鼠造模肢體的淤血程度、腫脹程度以及活動情況表現(xiàn)并分級評分。結(jié)果表明在給藥的第1、3、5、7天模型對照組與空白對照組具有顯著性差異，提示造模成功。在給藥第1天，扶他林軟膏組、五味消痛酊組與模型對照組相比沒有顯著性差異。在給藥第3、5、7天，與模型對照組相比五味消痛酊組大鼠損傷癥狀指數(shù)顯著降低（P<0.01）；在給藥第3天，扶他林軟膏組大鼠損傷癥狀指數(shù)顯著降低（P<0.05），在給藥第5、7天扶他林軟膏組大鼠損傷癥狀指數(shù)可顯著降低（P<0.01）；在給藥的第1、3天扶他林軟膏組大鼠損傷癥狀指數(shù)較五味消痛酊組稍低，但兩組沒有顯著性差異（P>0.05），在給藥的第5、7天五味消痛酊組大鼠損傷癥狀指數(shù)較扶他林軟膏組稍低，但兩組沒有顯著差異（P>0.05）。

表1 各組大鼠給藥后不同時間點損傷癥狀指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠給藥后不同時間點損傷癥狀指數(shù)比較（±s）

注：與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與空白對照組比較，△△P<0.01。下同。

組別空白對照組模型對照組扶他林軟膏組五味消痛酊組n 8 8 8 8第1天0±0 5.50±0.50△△5.25±0.66 5.38±0.86第3天0±0 5.00±0.87△△3.88±0.78*4.00±0.71**第5天0±0 3.38±0.86△△2.25±0.83**2.13±0.93**第7天0±0 2.50±0.50△△0.38±0.48**0.25±0.43**

2.2 各組大鼠PWT水平比較 見表2。在給藥第1、3、5、7天，模型組大鼠較空白組大鼠的PWT顯著降低（P<0.01）；在給藥第1天，雖然五味消痛酊組和扶他林軟膏組較模型組大鼠的PWT有所升高但無顯著性差異，這可能是由于給藥時間較短而造成的；在給藥第3、5、7天，五味消痛酊和扶他林軟膏PWT均可升高，且與模型組相比具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）；在給藥的第3、5、7天扶他林軟膏組大鼠的PWT值較五味消痛酊組低，但無顯著差異（P>0.05）。

表2 各組大鼠給藥后不同時間PWT水平比較（g，±s）

表2 各組大鼠給藥后不同時間PWT水平比較（g，±s）

images/BZ_56_223_1385_1227_1452.png空白對照組模型對照組扶他林軟膏組五味消痛酊組8 8 8 8 12.75±2.33 6.50±1.12△△7.88±1.90 8.13±1.45 12.88±2.20 5.75±1.39△△7.88±1.62*8.75±1.98*13.25±1.79 6.63±2.00△△8.75±1.20*9.38±1.11**12.88±2.26 6.88±1.45△△10.00±2.83*10.63±2.96*

2.3 各組大鼠血液流變學指標的比較 見表3。與空白對照組相比，模型對照組全血低切（10/s）、中切（60/s）、高切（150/s）黏度均顯著升高（P<0.01）；與模型對照組相比，五味消痛酊可顯著降低全血低切（10/s）、中切（60/s）、高切（150/s）黏度（P<0.01）。與空白對照組相比，模型對照組血漿黏度及血細胞比容顯著升高（P<0.01）；與模型對照組相比，五味消痛酊可顯著降低血漿黏度和血細胞比容（P<0.01），五味消痛酊組大鼠全血低切（10/s）、中切（60/s）、高切（150/s）黏度，血漿黏度及血細胞比容較扶他林軟膏組稍低，但無顯著差異（P>0.05）。

表3 各組大鼠全血黏度、血漿黏度與血細胞比容的比較（±s）

表3 各組大鼠全血黏度、血漿黏度與血細胞比容的比較（±s）

組別空白對照組模型對照組扶他林軟膏組五味消痛酊組n 8 8 8 8全血黏度（mPa·s）低切14.67±1.33 22.46±1.62△△18.11±1.74**16.72±1.71**中切9.90±1.78 13.75±1.13△△11.88±1.89*11.01±1.78**高切5.47±1.34 8.45±0.96△△6.22±1.01**5.92±0.61**血漿黏度（mPa·s）1.06±0.20 1.55±0.10△△1.25±0.19**1.18±0.17**血細胞比容（%）42.02±3.38 50.93±5.35△△43.27±3.18**42.46±5.31**

2.4 各組大鼠損傷組織中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平的比較 見表4。與空白對照組相比，模型對照組可顯著升高大鼠損傷組織中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平（P<0.01）；與模型對照組相比，五味消痛酊和扶他林軟膏可顯著降低大鼠損傷組織中PGE-2、TNF-α及IL-1β的表達水平（P<0.05或P<0.01），但IL-6水平均無顯著差異（P>0.05）；扶他林軟膏組與五味消痛酊組相比，損傷組織中PGE-2、TNF-α及IL-1β的表達水平無顯著差異（P>0.05）。

表4 各組大鼠損傷組織中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平比較（ng/mL，±s）

表4 各組大鼠損傷組織中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平比較（ng/mL，±s）

images/BZ_56_1310_760_2315_827.png空白對照組模型對照組扶他林軟膏組五味消痛酊組8 8 8 8 235.63±38.52 319.48±50.50△△255.04±43.42**271.15±34.45*33.13±6.05 53.24±9.28△△43.95±8.17*41.79±9.44*55.69±6.47 73.00±15.92△△59.55±13.40*67.88±13.72**13.39±2.51 18.31±1.90△△15.65±2.15 14.71±2.98

3 討 論

閉合性軟組織損傷是常見病和多發(fā)病，屬于中醫(yī)“傷筋”范疇，《雜病源流犀燭·跌仆閃挫源流》“跌打閃挫，猝然身受，由外及內(nèi)，氣血俱傷”“氣滯何處則血凝何處”?！镀諠健ふ蹅T》“若因傷折內(nèi)動經(jīng)絡，血行之道不得宣通。瘀積不散，為腫為痛”。由此可知閉合性軟組織損傷的主要病機是氣滯血瘀，疼痛和腫脹是其主要臨床表現(xiàn)［5］?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明閉合性軟組織損傷是在組織受傷后出現(xiàn)細胞死亡、出血、凝血等現(xiàn)象，隨即觸發(fā)炎癥反應，出現(xiàn)紅腫、淤血、疼痛、行動力降低等臨床表現(xiàn)［6］。炎癥反應伴隨著組織損傷的發(fā)生而發(fā)展，PGE-2是花生四烯酸代謝途徑的產(chǎn)物，可協(xié)同趨化因子、增強血管通透性，從而吸引中性粒細胞引起發(fā)熱，參與痛覺產(chǎn)生引發(fā)炎癥損傷［7］；TNF-α是重要的炎癥介質(zhì)，可激活p38-MAPK通路，改變細胞膜通透性，使Na+內(nèi)流，降低興奮性閾值，產(chǎn)生痛覺，組織損傷［8］；IL-1β與IL-6可激炎癥介質(zhì)傳遞和細胞因子產(chǎn)生，進而引起組織損傷［9］。五味消痛酊可以改善急性閉合性軟組織損傷大鼠的淤血程度、腫脹程度，改善損傷后肢的行動力；可以降低全血黏度、血漿黏度、血細胞比容，改善局部淤血；可以提高損傷大鼠的疼痛縮足反射閾值，發(fā)揮鎮(zhèn)痛的作用；同時通過降低大鼠損傷組織中PGE-2、TNF-α、IL-1β的表達水平進而改善炎癥引起的組織損傷。

五味消痛酊方中五味藤、蘇木、三七具有消腫止痛、活血散瘀的功效?，F(xiàn)代研究表明五味藤有抗炎止痛的作用［10］。蘇木具有較強的抗炎、血管舒張等藥理活性［11］。三七具有活血與止血雙向調(diào)節(jié)和抗炎的作用，三七素為三七中主要的止血成分，三七黃酮為主要活血抗炎成分［12］。歸尾活血，有祛瘀而不傷血之妙，在當歸的3個部位中，歸尾中阿魏酸的含量最高，阿魏酸具有抑制血小板聚集、抗血栓等藥理作用［13］。山香可行氣散瘀，現(xiàn)代研究表明山香具有鎮(zhèn)痛、抗炎和傷口愈合的作用［14］。桂枝具有溫通經(jīng)脈、通陽化氣之功效，表現(xiàn)出改善微循環(huán)、抗炎、抗血小板凝集等多種生理活性［15］。荊芥、重樓具有抗炎、鎮(zhèn)痛、止血的作用［16-17］。紫草可清熱解毒、涼血止血，具有抗炎等藥理活性［18］。五味消痛酊為酊劑，局部用藥時通過創(chuàng)傷表面經(jīng)皮吸收，避免肝臟的首過效應，保持局部的血藥濃度，對于治療急性閉合性軟組織損傷具有一定優(yōu)勢。五味消痛酊既可起到鎮(zhèn)痛作用，通過治標解決患者的疼痛，又可以通過改善血液流變學，抗炎進而治本。

綜上所述，五味消痛酊對于急性閉合性軟組織損傷具有一定治療作用，提高大鼠的疼痛閾值，并且可通過降低PGE-2、TNF-α、IL-1β的表達水平改善炎癥引起的組織損傷。本實驗對五味消痛酊的抗炎、鎮(zhèn)痛以及對于急性閉合性軟組織損傷的治療作用進行了一定的研究，為后續(xù)更深入的作用機制研究以及活性成分的尋找奠定了一定的基礎。