郭小文，任青，張?chǎng)?，李敏婷，李雪玲，彭?/p>

1 南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510315；2 南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院治未病中心

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎為主要病理特征的自身免疫性疾病，屬中醫(yī)學(xué)“痹病”或“歷節(jié)”的范疇［1］。目前，RA 治療方案多種多樣，但其療效及患者滿意度均欠佳［2］。長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥具有多成分、多通路、多靶點(diǎn)治療優(yōu)勢(shì)，目前已越來越多的用于RA 的治療中［3］。關(guān)節(jié)活絡(luò)丸（Guanjie Huoluo Pill，GJHL）是我院長(zhǎng)期應(yīng)用的治療RA 院內(nèi)制劑，具有滋補(bǔ)肝腎、益氣養(yǎng)血、舒筋活絡(luò)、散寒止痛之功效。我們前期共納入106 例RA 患者，采用GJHL 治療后達(dá)到臨床治愈18例、顯效34例、好轉(zhuǎn)43例、無效11例，治療總有效率高達(dá)88.62%，但GJHL 治療RA 的具體作用機(jī)制尚不明確。2017 年6 月起，我們制備膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（Collagen induced arthritis，CIA）模型大鼠，觀察GJHL 的治療效果，探討其抗炎的主要藥理作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步研發(fā)RA治療新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 SPF 級(jí)Wistar 大鼠32 只，雄性，體質(zhì)量120～150 g，購自于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，設(shè)施使用許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0034。弗氏完全佐劑、Ⅰ型膠原蛋白水解酶（美國Sigma 公司），雞Ⅱ型膠原蛋白（上海遠(yuǎn)慕）制備Ⅱ型膠原蛋白乳化液：在冰浴條件下，將2 mg/mL的Ⅱ型膠原蛋白溶液（將雞II 型天然膠原溶解于0.l mol/L醋酸溶液中搖床過夜）2 mL 與等體積的完全弗氏佐劑混合，總體積為4 mL，終濃度1 mg/mL，使用電動(dòng)勻漿器以25 000～30 000 r/min 進(jìn)行混勻，每次2.5 min，暫停2.5 min，反復(fù)3～4 次，至形成油包水白色乳液，滴至水中不擴(kuò)散。大鼠白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）ELISA 檢測(cè)試劑盒（深圳欣博盛）、GJHL 由黃芪、枸杞子、淫羊藿、黃精（制）、牛膝、細(xì)辛、桑枝、秦艽、桂枝、雷公藤、丹參、雞血藤、薏苡仁、山藥、茯苓組成，由南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥房提供（粵藥制字Z20110010），將GJHL 溶于純凈水至濃度為0.252 g/mL。來氟米特（LEF，5 mg/片，蘇州長(zhǎng)征—欣凱制藥有限公司，批號(hào)：H20060034）純凈水溶至濃度為0.525 mg/mL，PV-200 足趾容積測(cè)量?jī)x（成都泰盟科技有限公司），EPOCH酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.2 CIA誘導(dǎo)及GJHL給予方法 32只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為GJHL組、陰性對(duì)照（NC）組、空白對(duì)照（BC）組、來氟米特（LEF）組，每組各8 只，除NC 組外，其余3組大鼠參照文獻(xiàn)［4］及雞Ⅱ型膠原蛋白說明書制備CIA 模型：大鼠于尾根部注射0.2 mL 膠原+CFA 乳劑進(jìn)行首次免疫，造模第7 天于大鼠尾根部注射0.1 mL 膠原+IFA 乳劑進(jìn)行增強(qiáng)免疫。7 天觀察并記錄各組大鼠踝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritic Index，AI），若AI≥4 表示造模成功。誘導(dǎo)成功后，GJHL組、LEF組分別予GJHL、LEF混懸液灌胃，NC、BC 組大鼠予等劑量純凈水灌胃，10 mL/kg，2 次/天，連續(xù)灌胃28 d。

1.3 各組大鼠AI、關(guān)節(jié)腫脹率測(cè)算 ①分別于灌胃第1（給藥前）、7、14、21、28 天觀察并記錄各組大鼠踝關(guān)節(jié)的AI。單個(gè)肢體AI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0 分：無關(guān)節(jié)紅腫；1 分：踝關(guān)節(jié)或足趾的輕度紅腫；2 分：踝關(guān)節(jié)的中度紅腫；3 分：包括趾關(guān)節(jié)在內(nèi)的全足明顯紅腫；4 分：多足明顯紅腫伴關(guān)節(jié)變形、功能障礙。每只大鼠的AI 評(píng)分最高為16 分。②分別于灌胃第1（給藥前）、7、14、21、28 天采用容積法檢測(cè)大鼠左右后肢體積，用大鼠足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠右后肢趾關(guān)節(jié)毛際以下的容積（mL）。計(jì)算其關(guān)節(jié)腫脹率，以第1 天測(cè)值為基值，以后每次測(cè)得的值與之相比所得比值記為關(guān)節(jié)腫脹率。

1.4 各組大鼠血清及關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α 檢測(cè) ①灌胃第28 天，1 mL/200 g 腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采用腹主動(dòng)脈采血法采血，4 ℃離心，取上清，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)量OD450值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)算各組大鼠IL-6、TNF-α。重復(fù)3 次，取平均值。灌胃第28天時(shí)無菌條件下取出大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，參照文獻(xiàn)［5］對(duì)滑膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。取滑膜細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-6、TNF-α。

1.5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化觀察 灌胃第28 天取各組大鼠踝關(guān)節(jié)，經(jīng)固定、脫鈣、石蠟包埋處理后，切成5 μm 切片，進(jìn)行HE 染色。光鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞和血管的增生，滑膜層及滑膜下層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和軟骨的增生及破壞等情況。踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分參照文獻(xiàn)［6］分別從滑膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質(zhì)侵蝕評(píng)分，5 個(gè)評(píng)分總分即為病理評(píng)分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以表示，對(duì)多個(gè)樣本的均數(shù)采用方差分析進(jìn)行比較，組間比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同灌胃時(shí)間點(diǎn)各組大鼠踝關(guān)節(jié)AI、腫脹率比較 灌胃后GJHL 組、LEF 組大鼠于第14 天開始關(guān)節(jié)紅腫、畸形程度較BC 組輕，AI 評(píng)分較低（P＜0.05）。結(jié)果見表1、2。

表1 不同灌胃時(shí)間點(diǎn)各組大鼠踝關(guān)節(jié)AI比較（分，）

表1 不同灌胃時(shí)間點(diǎn)各組大鼠踝關(guān)節(jié)AI比較（分，）

注：與BC組比較，*P＜0.05；與NC組比較，△P＜0.01。

表2 不同灌胃時(shí)間點(diǎn)各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹率比較（%，）

表2 不同灌胃時(shí)間點(diǎn)各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹率比較（%，）

注：與BC組比較，*P＜0.05；與NC組比較，△P＜0.01。

2.2 灌胃第28 天各組大鼠血清及關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-6、TNF-α 水平比較 經(jīng)LEF、GJHL 灌胃后，CIA 大鼠血清及關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-6、TNF-α 水平均較BC 組低。結(jié)果見表3。

表3 灌胃第28天各組大鼠血清及關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，）

表3 灌胃第28天各組大鼠血清及關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，）

注：與BC組比較，*P＜0.05；與NC組比較，△P＜0.01。

2.3 灌胃第28 天各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理比較 3 組CIA 大鼠均有不同程度的滑膜細(xì)胞增生及侵蝕、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳生成、骨質(zhì)破壞，但經(jīng)LEF、GJHL 灌胃后，其程度及病理評(píng)分均較BC 組低（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分（分，）

表4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分（分，）

注：與BC組比較，*P＜0.05；與NC組比較，△P＜0.01。

3 討論

RA 是一種關(guān)節(jié)滑膜炎癥持續(xù)存在的慢性自身免疫性疾病，常導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞畸形。目前抗炎的主要治療手段有生物制劑、非甾體類抗炎藥等，這些藥物雖然能有效的控制RA 的炎癥反應(yīng)，但是仍有較大的毒副作用且價(jià)格昂貴，給患者帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找療效確切、毒副作用小的治療藥物非常重要。RA 屬于中醫(yī)風(fēng)濕病（痹病、痹證）范疇，中醫(yī)認(rèn)為基本病機(jī)是，感受風(fēng)寒濕熱之邪，或因日久正虛，內(nèi)生痰濁，瘀血正邪相搏，使經(jīng)絡(luò)、肌膚、血脈，筋骨，甚則臟腑的氣血痹阻，而出現(xiàn)肢體關(guān)節(jié)的腫脹，重著變型、僵直等癥，甚則累及臟腑。《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載外邪侵入人體是導(dǎo)致痹病發(fā)生的重要條件。歷代眾多醫(yī)家通過臨床觀察，總結(jié)出風(fēng)寒濕三氣中但見二氣復(fù)合侵入體內(nèi)，即可致痹?！罢龤獯鎯?nèi)，邪不可干”，痹病發(fā)病除外因外，其內(nèi)因不可小覷，而痹病的主要內(nèi)因是因?yàn)楦文I不足、氣血虧虛。我院院內(nèi)制劑關(guān)節(jié)活絡(luò)丸內(nèi)外因兼顧組方，方以黃芪配枸杞補(bǔ)益氣血；淫羊藿配黃精、續(xù)斷、牛膝溫補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋壯骨；細(xì)辛、桑枝、秦艽、雷公藤、桂枝溫散風(fēng)寒、祛風(fēng)通絡(luò)；丹參、雞血藤活血通絡(luò)；薏苡仁、山藥、茯苓健脾祛濕、消腫。黃芪、淫羊藿、枸杞子、續(xù)斷、牛膝等陰陽共進(jìn)，補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋健骨，還可增強(qiáng)對(duì)雷公藤、細(xì)辛之毒性的耐受力，防其毒傷正之弊。全方標(biāo)本兼顧，風(fēng)寒濕并祛，并作成丸劑緩圖，對(duì)RA 患者的關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、關(guān)節(jié)僵硬等癥具有較好療效，臨床應(yīng)用廣泛。其起效的作用機(jī)制并未明確。

CIA 大鼠是以慢性、多發(fā)性末端關(guān)節(jié)炎主的免疫性炎癥模型，能夠很好的模擬人RA 炎癥反應(yīng)，在研究免疫反應(yīng)、新藥研發(fā)及療效評(píng)價(jià)等方面都具有明顯的優(yōu)勢(shì)［7］。CIA 大鼠致敏第7 天開始出現(xiàn)輕度炎癥，第14 天炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，第21 天出現(xiàn)血管翳形成及軟骨破壞，5～6 周后才出現(xiàn)明顯的骨侵蝕現(xiàn)象［8］，因此對(duì)其進(jìn)行藥物干預(yù)28 天可以明顯反應(yīng)出藥物的抗炎作用及軟骨保護(hù)作用。RA 病理改變主要累及關(guān)節(jié)滑膜，表現(xiàn)為滑膜炎。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GJHL 能夠明顯減輕CIA 的紅腫程度及關(guān)節(jié)腫脹率，療效與LEF類似。

IL-6是多效性前炎癥細(xì)胞因子，在RA炎癥過程中起著重要作用，主要包括：影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的平衡，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松；與受體或者多種炎癥因子結(jié)合后作用于多條信號(hào)通路而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)［9］。RA 患者的血清和滑膜液中的IL-6 水平具有所升高，且其水平與RA 的疾病活動(dòng)度和影像學(xué)的關(guān)節(jié)破壞程度正相關(guān)。進(jìn)一步研究［9］發(fā)現(xiàn)，RA 的關(guān)節(jié)外癥狀如貧血、疲勞、急性反應(yīng)蛋白升高等也與IL-6 的全身系統(tǒng)性作用密切相關(guān)。這些均提IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是RA 發(fā)病過程中起著重要的作用，也可能是治療RA 的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中GJHL 能降低CIA 大鼠血清和滑膜細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6 的含量，提示GJHL起到抗炎作用的作用機(jī)制與IL-6相關(guān)。

TNF-α主要由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，滑膜襯里層的非炎癥細(xì)胞滑膜巨噬細(xì)胞也能產(chǎn)生［10］，其參與的誘導(dǎo)炎性細(xì)胞聚集和激活、促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)成纖維滑膜細(xì)胞產(chǎn)生骨和軟骨破壞的細(xì)胞因子和蛋白酶、刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生其他細(xì)胞因子等活動(dòng)導(dǎo)致RA 患者出現(xiàn)一系列的病理變化［10］，它與IL-6又能相互影響，并都參與了骨質(zhì)破壞的過程［11］。因此，抑制TNF-α 的分泌也能很好的控制住炎癥過程及骨質(zhì)破壞情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GJHL 能降低CIA 大鼠血清和滑膜細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α 的含量，這也說明GJHL 的抗炎作用很可能是通過抑制TNF-α的分泌實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，GJHL 對(duì)CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎具有良好的治療效果，GJHL 溶液灌胃可降低CIA 大鼠四肢AI、關(guān)節(jié)腫脹率、踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分，其機(jī)制可能為GJHL降低血清及關(guān)節(jié)滑膜組織IL-6、TNF-α表達(dá)。