紜玲 高洪梅 李碩 楊爍 王海濤 崔慧娟 劉煥亮 付源★

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種以進(jìn)行性記憶喪失和認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)退行性疾病［1］。細(xì)胞外β?淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）沉積，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（Neurofibril?lary tangles，NFTs）伴神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)細(xì)胞活化是AD 病理特征［2］。流行病學(xué)調(diào)查顯示65 歲以上人群中每10 人就有一人患病，85 歲以上人群中每3 人就有1 個(gè)患者［3］。AD 已成為全球嚴(yán)重的醫(yī)療和社會問題之一，給社會和家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)。目前對AD 尚無有效治療方法，而早期診斷AD 有助于早期干預(yù)及延緩疾病進(jìn)展。生物化學(xué)改變發(fā)生于臨床癥狀出現(xiàn)前20年，所以檢測生物標(biāo)志物是AD早期診斷的重要工具［4］。本文就AD 早期分子診斷研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以幫助早期治療、早期預(yù)防。

1 基因檢測

AD 根據(jù)發(fā)病年齡分為早老性AD（early?onset AD，EOAD）與遲發(fā)型AD（late?onset AD，LOAD），EOAD 占所有AD 病例5%以下，LOAD 占所有AD病例的95%以上［5］。研究發(fā)現(xiàn)EOAD 主要由β?淀粉樣蛋白前體（APP）、早老素?1（PSEN1）和早老素?2（PSEN2）基因突變引起，這些錯(cuò)義基因可協(xié)助早期診斷AD［6］，其突變之后可導(dǎo)致腦組織發(fā)生氧化損傷，引起腦內(nèi)Aβ 的產(chǎn)生和清除的失平衡，進(jìn)而形成Aβ 異常沉積所形成的老年斑（Amyloid Plaque），最終出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡［7］?；蛲蛔兊姆诸惸壳叭匀痪哂刑魬?zhàn)性，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)不同EOAD患者體內(nèi)存在多個(gè)突變，如PSEN1的兩個(gè)新突變（Y256N 和H214R）、致病性PSEN1Trp165Cys 突變、PSEN1G209A 突變，這些基因突變位點(diǎn)的篩查可為臨床早期診斷AD 提供突變序列，未來還將從蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)同步檢查，并整合這兩個(gè)組學(xué)分析的數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究其可能的致病機(jī)制［8?11］。

載脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE）基因被廣泛認(rèn)為是LOAD 的易感基因，其中APOE ε4等位基因是LOAD 發(fā)病的最強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)因素，與AD 大腦中Aβ 異常沉積密切相關(guān)［12］。攜帶APOE ε4基因亞型的AD 模型小鼠腦內(nèi)Aβ 的異常沉積主要發(fā)生在Aβ 形成早期，而不影響中晚期Aβ 沉積［13］。脂質(zhì)化apoE 與Aβ 競爭性結(jié)合細(xì)胞膜表面HSPG 受體，抑制神經(jīng)細(xì)胞攝取Aβ，導(dǎo)致Aβ 清除減慢，此作用具有濃度依賴性［14］。APOE ε4轉(zhuǎn)基因小鼠中炎癥因子環(huán)孢素A 和基質(zhì)金屬蛋白酶?9 通過加速血腦屏障周細(xì)胞的降解，引起血腦屏障破壞，進(jìn)而影響血腦屏障介導(dǎo)的外源性Aβ 的清除［15］。此外，APOE ε4激活Erk 途徑、降低細(xì)胞自噬清除tau 蛋白、誘發(fā)腫瘤壞死因子?α 分泌產(chǎn)生炎癥反應(yīng)等途徑加劇tau 蛋白異常磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元退行性改變［16］，這些關(guān)鍵的病理變化可協(xié)助早期篩查LOAD 患者。

全基因組關(guān)聯(lián)研究證實(shí)了CD33基因與AD 發(fā)病具有關(guān)聯(lián)性，其表達(dá)的CD33 蛋白在大腦中主要由小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，對小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的Aβ 的攝取發(fā)揮抑制作用，是LOAD 易感基因位點(diǎn)，利用靜息狀態(tài)功能磁共振成像發(fā)現(xiàn)CD33基因型主要影響額葉?紋狀體環(huán)路中腦功能，在海馬旁回中也觀察到CD33基因型和AD 之間存在相互作用，這些發(fā)現(xiàn)為CD33基因型對認(rèn)知功能的影響提供了進(jìn)一步的見解［17?18］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)攜帶微管相關(guān)蛋白tau（Microtubule?associated protein tau，MAPT）基因患者腦脊液t?tau 和p?tau 水平顯著增加，表明MAPT基因可作為早期診斷AD 有效的篩查基因，但仍需要進(jìn)一步明確其基因多態(tài)性與AD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性［19］。所以驗(yàn)證這些基因準(zhǔn)確預(yù)測疾病發(fā)生的能力并明確可能的致病機(jī)制非常重要。

2 生物學(xué)標(biāo)志物檢測

AD 相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物檢測主要以腦脊液檢查為主，隨著技術(shù)手段的進(jìn)步，在外周血液等其他組織也正在試圖尋找簡便有效的早期診斷生物標(biāo)志物。根據(jù)國際工作組織和美國國立老化研究院建立的診斷標(biāo)準(zhǔn)，腦脊液Aβ1?42水平下降、總tau、磷酸化tau 水平上升被認(rèn)為是有效的AD 支持性診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。Lewczuk 等人［20?21］報(bào)道腦脊液中Aβ42 降低對AD 診斷的敏感性為69.3%，特異性則可達(dá)到88.9%，Aβ42/Aβ40 降低的敏感性和特異性分別為93.3%和100%，在臨床常規(guī)條件下腦脊液Aβ42/Aβ 40 代替Aβ42 可以提高診斷準(zhǔn)確性，然而腦脊液生物標(biāo)志物的可變性太高（包括運(yùn)輸、實(shí)驗(yàn)方法、參考值等的影響），臨床界限值確定存在較大困難，下一步需要標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室條件，識別和連續(xù)優(yōu)化影響因素。Aβ1?42和p?tau 是腦脊液生物學(xué)標(biāo)志物的最佳組合，可以預(yù)測輕度認(rèn)知功能障礙患者發(fā)生AD 的總體風(fēng)險(xiǎn)，有利于對AD 患者進(jìn)行早期干預(yù)［22］。視錐蛋白樣蛋白1（Visinin?like protein?1，VILIP?1）是一種神經(jīng)元內(nèi)鈣傳感蛋白，在腦損傷模型和基因陣列分析中已被證實(shí)可作為神經(jīng)元損傷的指標(biāo)，其可作為神經(jīng)元丟失病理過程的累積結(jié)果。因此，捕捉神經(jīng)元變性丟失的腦脊液標(biāo)志物可能對未來的認(rèn)知下降提供預(yù)測價(jià)值。據(jù)此，有研究發(fā)現(xiàn)腦脊液VILIP?1 水平與情景記憶和語義記憶能力下降有關(guān)，與AD 早期顳葉內(nèi)側(cè)萎縮病理改變具有一致性，CSF 中VILIP?1和VILIP?1/Aβ42 可作為早期AD 患者認(rèn)知功能下降的預(yù)測模型，其作用與tau 和tau/Aβ42 類似，可能成為AD 早期神經(jīng)變性的有效CSF 替代物［23］。

由于腦脊液檢測的有創(chuàng)性和普及難度大，而血液采集具有極大的簡便性，大家開始把目光轉(zhuǎn)向血液生物標(biāo)志物。由于血漿中Aβ 的含量較低，且干擾測量的特定血液蛋白質(zhì)和其他化合物含量過高，其免疫測量和定量受到阻礙。在極輕微AD、輕度認(rèn)知功能障礙（Mild cognitive impair?ment，MCI）和健康對照組的血漿中檢測t?tau 和p?tau蛋白水平，發(fā)現(xiàn)極輕微AD 和MCI 患者血漿t?tau和P?tau 水平高于健康對照組，極輕微AD 患者血漿t?tau 和p?tau 水平高于MCI 組，并且p?tau 相關(guān)性更顯著，表明血漿t?tau 和p?tau 均可協(xié)助篩查早期AD，但血漿p?tau 水平與AD 嚴(yán)重程度相關(guān)性高于血漿t?tau［24］。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)血清t?tau 和p?tau181 蛋白水平與蒙特利爾評分呈負(fù)相關(guān)，此結(jié)果支持血液t?tau 和p?tau 作為早期AD 的預(yù)測標(biāo)志物，有可能作為未來隨訪AD 患者預(yù)后的指標(biāo)［25］。分析MCI 和AD 患者血漿Micro RNA 轉(zhuǎn)錄組，microRNA?206 表現(xiàn)出與認(rèn)知能力下降和記憶缺陷的強(qiáng)烈相關(guān)性，五年以上的縱向隨訪發(fā)現(xiàn)，microR?NA?206 在認(rèn)知功能障礙發(fā)生之前異常增加，可用于預(yù)測MCI 階段認(rèn)知能力的下降［26］。

唾液生物學(xué)標(biāo)志物檢測是一種比血液更為簡便的方法，利用高度敏感的Luminex 分析法對唾液t?tau、p?tau 和Aβ42 蛋白水平進(jìn)行定量評估，結(jié)果顯示AD 患者的p?tau/t?tau 比值顯著增加，在S396 磷酸化位點(diǎn)變化更明顯［27?28］。這些結(jié)果表明，唾液tau 蛋白可能成為AD 早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，甚至可應(yīng)用于無癥狀受試者的篩查，進(jìn)而為AD 治療提供更大的時(shí)間窗［29］。此外，研究還顯示AD 患者的唾液Aβ42 水平明顯高于對照組［30］。綜上所述，唾液檢測可成為AD 早期診斷的關(guān)鍵方法。下一步有必要進(jìn)一步了解這些生物標(biāo)志物的聯(lián)用優(yōu)勢，進(jìn)行大樣本數(shù)據(jù)驗(yàn)證及建立可靠的臨界值和標(biāo)準(zhǔn)參考物。

3 影像學(xué)檢查

影像學(xué)技術(shù)發(fā)展對AD的診斷和預(yù)后判斷具有重要意義。AD 患者磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）檢查的主要改變是皮質(zhì)性腦萎縮和腦室擴(kuò)大伴腦溝裂增寬，但由于缺乏對AD 診斷的特異性，主要用于排除可引起癡呆的其他疾病。定量磁化率成像是磁共振成像中一項(xiàng)新興的用于定量測量組織磁化特性的技術(shù)，利用該技術(shù)證明Aβ 具有抗磁性，可在磁化率圖上產(chǎn)生強(qiáng)烈的對比，磁化率標(biāo)測可以用來檢測AD 小鼠模型中Aβ 斑塊的聚集［31?32］。

正電子發(fā)射斷層掃描淀粉樣蛋白顯像劑與大腦內(nèi)纖維狀淀粉樣蛋白沉積的結(jié)合，可視化和量化大腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積，可檢測AD 患者大腦內(nèi)Aβ 異常沉積，主要配體包括11C 和18F 標(biāo)記的放射性示蹤劑［33］。利用突觸囊泡糖蛋白2A PET 顯像測定突觸密度，可為阿爾茨海默病的早期診斷提供工具［34］。氟?2?脫氧?D?葡萄糖?正電子發(fā)射斷層掃描成像顯示，顳頂葉、額葉和后扣帶皮質(zhì)中的葡萄糖代謝減少是AD 的標(biāo)志，中晚期出現(xiàn)額葉皮質(zhì)受累，額葉受累與否，可作為鑒別AD 早期和中晚期的標(biāo)志［35］。應(yīng)用單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT）技術(shù)評估腦灌注變化，發(fā)現(xiàn)≥94%輕度AD患者的灌注值低于健康對照組的平均值，這一結(jié)果提示繪制低灌注的地形圖，可明確特定的早期灌注模式，幫助早期診斷AD［36］。由于目前還沒有確切規(guī)范的測量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)案例較少，下一步需要建立供臨床使用的標(biāo)準(zhǔn)并培訓(xùn)閱片人。

4 新技術(shù)展望

隨著視覺變異型AD（Visual variant of AD，VVAD）患者的發(fā)現(xiàn)，眼部標(biāo)志物逐漸進(jìn)入研究者的視線，有研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)AD 神經(jīng)病理學(xué)包括視網(wǎng)膜Aβ、tau 蛋白的積聚、神經(jīng)元丟失和RGC 凋亡，在AD 模型小鼠中發(fā)現(xiàn)其視網(wǎng)膜RGCc 層凋亡細(xì)胞的存在，視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞檢測技術(shù)是一種利用放射性annexin V 和聚光共聚焦掃描眼底鏡檢測凋亡細(xì)胞的方法，可以在AD患者中無創(chuàng)性顯示AD病理變化，這種成像技術(shù)的演變和發(fā)展可成為未來的AD診斷工具［37?38］。

生物傳感器是一種對生物物質(zhì)敏感并將其濃度通過識別元件識別后經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換為光、電等可測量信號進(jìn)行檢測的儀器，因其快速、低廉、簡便、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)成為診斷很多疾病的有前途的工具［39］。一種用于檢測Aβ 蛋白的免疫磁生物傳感器，利用sulfo?SMCC 交聯(lián)法將抗Aβ 抗體標(biāo)記在磁性氮摻雜石墨烯表面，形成磁性免疫載體，將磁性免疫載體放置在Au 電極上，在電極下方放置一個(gè)外部磁鐵進(jìn)行電化學(xué)Aβ 檢測，通過電流變化測定Aβ 蛋白濃度，該儀器目前只在體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，未來可考慮對AD 患者腦脊液、血液Aβ 蛋白濃度進(jìn)行測定，對AD 早期診斷有潛在的作用［40］。雖然這些技術(shù)優(yōu)勢顯而易見，但同時(shí)也需要解決可再生性、特異性、穩(wěn)定性等方面的問題，才可能使其成為未來的有效診斷工具。

5 結(jié)語

AD 目前尚無有效的治療手段，早期診斷和干預(yù)是控制AD 發(fā)生發(fā)展的重要措施。建立有效的分子診斷標(biāo)志物是AD 研究領(lǐng)域的重要難題。隨著醫(yī)療新技術(shù)的不斷發(fā)展，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有良好重復(fù)性及有效性，確立簡便、易行的診斷方法，將會為AD 診斷指明新方向。