何世成，王紫微，2，丁朝陽，胡巧云，唐小明，王衛(wèi)國，劉道新，謝怡靈，王昌建

（1.湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410014；2.衡陽技師學(xué)院，湖南衡陽 421101；3.婁底市動物疫病預(yù)防控制中心，湖南婁底 417000）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）具有環(huán)狀單股負鏈DNA 基因組，是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員[1]。PCV 按其致病性、抗原特異性可分為4 種基因型，分別為PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4 型[2]。PCV1 在1974 年 由Tischer 等[3]在 豬腎細胞中發(fā)現(xiàn)，此后證實該病毒不會造成豬細胞病變，對豬無致病性。PCV2 在20 世紀90 年代出現(xiàn)，隨后分布全球，具有嚴重致病性[4]。PCV3 是Palinski 等[5]于2016 年在患有豬皮炎和腎病綜合征的急性病死母豬中檢測發(fā)現(xiàn)的新型PCV。2019年張慧輝等[2]在湖南省患有嚴重臨床疾病的豬只中發(fā)現(xiàn)了另一種新的PCV，被命名為PCV4。

與PCV 相關(guān)的疾病包括豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、先天性震顫、繁殖障礙和增生性壞死性肺炎等。PCV 作為豬圓環(huán)病毒病的主要病原，在全國范圍內(nèi)廣泛存在。近年來，PCV2 和PCV3 的感染率呈逐年增加趨勢，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，而新發(fā)現(xiàn)的PCV4 也是對養(yǎng)豬業(yè)造成威脅的潛在致病因素。本研究通過對來自湖南省2017—2020 年部分地區(qū)的821 份樣品進行PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4 的熒光PCR檢測，了解湖南省PCV 流行情況，以期為湖南省豬圓環(huán)病毒病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 本研究樣品均于2017—2020 年由湖南省動物疫病預(yù)防控制中心收集并儲存于-80 ℃超低溫冰箱，共821 份樣品，包括采自湖南省14個市州豬場的151 份病豬心、肝、脾、肺和腎等組織（同一病豬組織混合研磨后算1 份樣品），其中2017 年68 份、2018 年32 份、2019 年23 份、2020 年28 份；2020 年4 月與12 月，采自湖南省14 個市州屠宰場的670 份豬淋巴結(jié)樣品。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 PCV1 和PCV2 型雙重實時熒光PCR 檢測試劑盒，PCV3 型實時熒光PCR 檢測試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司；DNase-Free Deionized Water 和2×SuperRealPreMix（Probe），購自天根生物科技有限公司。7500 Fast Real-Time PCR System，購自賽默飛ABI 公司；組織研磨儀，購自德國Retsch；核酸提取儀和病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購自西安天隆科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 在生物安全柜中用無菌剪刀剪下一小塊組織放于2.0 mL 離心管中，加入研磨鋼珠和1.5 mL 生理鹽水，并編號，對稱放置于組織研磨儀研磨3 min，12 000 r/min 離心5 min。根據(jù)西安天隆自動化核酸提取儀說明進行核酸提取，提取核酸保存于-30 ℃。

1.2.2 引物合成 PCV1、PCV2 和PCV3 檢測所用引物和探針均由試劑盒提供。PCV4 檢測根據(jù)文獻[2]建立的熒光PCR 方法進行。引物和探針，由擎科生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCV4 熒光PCR 的引物信息

1.2.3 熒光PCR 檢測 PCV1 和PCV2 檢測，根據(jù)PCV1 和PCV2 型雙重實時熒光PCR 檢測試劑盒說明書進行；PCV3 檢測，根據(jù)PCV3 型實時熒光PCR 檢測試劑盒說明書進行；PCV4 檢測反應(yīng)總體系為20.0 μL：無核酸酶水5.4 μL，2×SuperReal PreMix（Probe）10.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，探針0.4 μL，DNA 模板3.0 μL。熒光PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，63 ℃ 35 s，進行50 次循環(huán)，在每次循環(huán)的第二步（63 ℃ 35 s）時收集熒光信號。

1.2.4 結(jié)果描述及判定 PCV1、PCV2、PCV3 的檢測結(jié)果判定，按試劑盒使用說明書標準；PCV4的檢測結(jié)果判定，當Ct ＜45 并出現(xiàn)特定的擴增曲線時判為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 總體情況

821 份樣品的病原檢測結(jié)果（表2）顯示：PCV2 陽性檢出率最高，為81.49%；PCV3、PCV1陽性檢出率次之，分別為33.98%和8.04%；PCV4陽性檢出率最低，為1.10%。上述結(jié)果說明目前已知的4 種PCV 基因型在湖南省內(nèi)均有分布，以PCV2 感染為主。

表2 兩種樣品不同血清型PCV 的陽性率 %

2.2 混合感染情況

821 份樣品中，存在PCV 感染的723 份，陽性檢出率為88.06%，其中PCV1、PCV2、PCV3單一感染在723 份感染樣品中分別占3.46%、55.0%和3.04%，無PCV4 單一感染。

723 份PCV 感染樣品中，有278 份樣品存在雙重或三重混合感染，主要表現(xiàn)為雙重感染，占93.17%。雙重感染中，以“PCV2+PCV3”為主，陽性檢出率為82.01%，而其他雙重感染類型的陽性檢出率較低，其中“PCV1+PCV2”為7.19%，“PCV1+PCV3” 為1.80%，“PCV2+PCV4” 為1.80%，“PCV3+PCV4”為0.36%；三重感染中，“PCV1+PCV2+PCV3”陽性檢出率為5.76%，“PCV2+PCV3+PCV4”為1.08%。

2.3 不同地區(qū)情況

2.3.1 臨床病料樣品 臨床病料樣品檢測結(jié)果（表3）顯示，在151 份臨床病料樣品中，PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4 的陽性檢出率分別為4.64%、69.54%、16.56% 和3.31%。其中：PCV1與PCV2 陽性檢出率最高的是湘北地區(qū)，分別為10.00%和80.00%；PCV3 陽性檢出率最高的是湘東地區(qū)，為32.61%；PCV4 僅在湘西地區(qū)檢測出5例陽性，分別來自3 個豬場。

表3 各地區(qū)臨床病料樣品中不同基因型PCV 陽性檢出率%

2.3.2 屠宰豬群淋巴結(jié)樣品 豬淋巴結(jié)樣品檢測結(jié)果（表4）顯示，在670 份屠宰場樣品中，PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4 的陽性檢出率分別為8.81%、84.18%、37.91% 和0.60%。其中：PCV1 陽性檢出率最高的是湘南地區(qū)，為16.67%；PCV2 陽性檢出率較高的是湘北和湘西地區(qū)，分別為92.73%和91.54%；PCV3 陽性檢出率較高的是湘西和湘中地區(qū)，分別為57.69%和45.71%；PCV4 只在湘東地區(qū)檢出4 例，陽性檢出率為2.86%。

表4 不同區(qū)域淋巴結(jié)樣品中不同基因型PCV 陽性檢出率%

3 討論

檢測結(jié)果顯示，PCV 在湖南省以PCV2 流行最為廣泛，平均陽性檢出率高達81.49%。從樣品的混合感染情況可以看出，湖南省的PCV 感染以PCV2 單一感染及“PCV2+PCV3”混合感染為主，在陽性樣品中的占比分別為55.0%和82.01%。

PCV1 普遍被認為不具有致病性，因此有關(guān)我國PCV1 檢測的報道較少。在已有的報道[6-8]中，PCV1 陽性率為6.3%～34.0%。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)湖南省PCV1 陽性檢出率為8.04%，與已有報道基本一致。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PCV1 在湖南省各地區(qū)均有分布，且健康屠宰豬樣品陽性檢出率高于臨床病料，但陽性率均低于10%，其原因可能與PCV1 不具有致病性有關(guān)。

PCV2 在湖南省流行已有較長時間。研究[10]表明，2017—2018 年湖南省PCV2 陽性率為70.7%。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)PCV2 陽性檢出率為81.49%，略高于同時間段的其他報道，這可能與本次調(diào)查的樣品既有臨床健康屠宰豬群，也有臨床發(fā)病豬群有關(guān)，但調(diào)查數(shù)據(jù)均表明PCV2 在湖南省流行較為嚴重。

PCV3 早在2014 年就已在我國部分地區(qū)商業(yè)豬場出現(xiàn)，而湖南省的感染情況于2017 年才被首次報道[12]。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)PCV3 陽性檢出率為33.98%，略高于劉相聰[13]2018 年對湖南省的PCV3 檢測結(jié)果（30.43%），表明湖南省PCV3 流行可能有上升趨勢。

PCV4 于2019 年在湖南省首次被發(fā)現(xiàn)[2]。本調(diào)查共檢出PCV4 陽性9 份，陽性檢出率為1.10%，與國內(nèi)其他報道[14-16]相似。Zhang 等[2]2020年檢測發(fā)現(xiàn)，湖南湘東、湘西、湘南和湘中地區(qū)均有PCV4 分布，其中湘中地區(qū)較多，占75%，而湘西地區(qū)無陽性。但本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，湖南省PCV4 呈小范圍分布，僅在湘西地區(qū)2017 年臨床病料樣品和湘東地區(qū)2020 年屠宰場健康豬組織樣品檢測到PCV4 陽性，說明湖南省PCV4 早在2017 年就已經(jīng)存在，其流行范圍開始逐步擴大，需要引起重視，加強監(jiān)測。

4 結(jié)論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)：PCV1、PCV2 和PCV3 在湖南省內(nèi)分布廣泛，其中PCV2 流行最為嚴重，需要加強防控；PCV4 在湖南省呈局部分布，但流行范圍有逐步擴大趨勢，需要加強監(jiān)測。