趙煥云，張海楠，魯富有，解明華，曾邦權(quán)，陳云明，呂 嶸，李錫慧，張文東

（1.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明 650000；2.普洱市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南普洱 665000；3.寧洱縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南寧洱 665199；4.臨滄市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南臨滄 677000；5.玉溪市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南玉溪 653100）

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）感染豬引起的一種臨床上以沉郁、多器官出血、高熱、高死亡率為特征的高度接觸性傳染病，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列入須通報(bào)動(dòng)物疫病名錄[1-2]，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的一類動(dòng)物疫病，是《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020 年）》中明確的優(yōu)先防治病種[3-6]。

CSFV 屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus），其基因組為12 kb 左右的單股正鏈RNA，含有1 個(gè)大的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）。ORF 編碼的大蛋白在病毒與宿主蛋白酶作用下形成4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C、Ems、E1 和E2）和8 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B）[7]。CSFV 只 有1個(gè)血清型，依據(jù)E2基因分為3 個(gè)基因型（1～3）、11 個(gè)亞型（1.1～1.4、2.1～2.3、3.1～3.4），其中2.1亞型又可進(jìn)一步分為2.1a、2.1b、2.1c 和2.1d 共4個(gè)分支[8-10]。野豬是CSFV 的自然貯存宿主。我國(guó)野豬資源豐富，但僅有少量野豬感染CSFV 的報(bào)道[11-12]，更未見(jiàn)到關(guān)于野豬源CSFV 的分子流行病學(xué)報(bào)道。

本研究對(duì)近期從云南省寧洱縣同心鎮(zhèn)山林中2 頭死亡野豬分離到的2 株CSFV 毒株（YNPEwildboar3180919、YNPEwildboar4180919）進(jìn)行了E2及5'NTR 基因序列測(cè)定分析，以了解云南省野豬體內(nèi)CSFV 的基因變異情況，從而為云南省CSF 防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

2 份豬脾、肺組織樣品，分別來(lái)自寧洱縣2 頭病死野豬，低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。

1.2 質(zhì)粒與菌種

TaKaRa pMD18-T 載體，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DH5α 大腸埃希氏菌，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑

一步法RT-PCR 試劑盒（TaKaRa One Step RNA PCR Kit/AMV）、PCR 擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa PCR Amplification kit）、PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒、質(zhì)粒（小量）抽提試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；全自動(dòng)核酸提取試劑盒，購(gòu)自西安天隆公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

參考Alexander 等[13]的E2和5'NTR 基因序列設(shè)計(jì)引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成。收到引物后用DEPC 水稀釋至20 pmol/μL，-20 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 核酸提取

按照自動(dòng)核酸提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，從研磨好的病料組織上清液中提取病毒基因組RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 E2 和5'NTR 基因RT-PCR 擴(kuò)增

采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）試劑盒，以提取的總RNA 為模板，經(jīng)RT-PCR 對(duì)E2和5'NTR 基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。按照試劑盒提供的操作手冊(cè)配制反應(yīng)體系，進(jìn)行反應(yīng)條件篩選和優(yōu)化。反應(yīng)條件：50 °C，30 min；94 °C，2 min；（95 °C，15 s；45～55 °C，15～30 s；72 °C，30～45 s）×35；72 °C，7 min；4 °C 或-20 °C保存。取5 μL 進(jìn)行電泳分析，預(yù)期E2基因產(chǎn)物大小約1 500 bp，5'NTR 基因產(chǎn)物大小約270 bp。

1.7 PCR 產(chǎn)物純化、克隆及測(cè)序

按照試劑盒操作手冊(cè)，對(duì)RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠切割純化，經(jīng)電泳定量后，稀釋至50 ng/μL。取1 μL 純化產(chǎn)物與1 μL pMD18-T 載體（50 ng/μL），按操作手冊(cè)進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃孵育30 min 后，涂布于0.1 mg/mL Ampcilin 抗性平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；采用質(zhì)粒引物及目的基因上下游引物，對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定；陽(yáng)性菌落接種5 mL 含Ampcilin 的LB 培養(yǎng)液中增殖培養(yǎng)后，采用試劑盒提取質(zhì)粒，電泳分析確認(rèn)后，送寶生物（大連）有限公司測(cè)序。

1.8 序列比對(duì)分析

采用DNAMAN、MEGA6.0 等分子生物學(xué)軟件，將測(cè)得的2 個(gè)毒株基因序列與參考毒株序列進(jìn)行同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析。比對(duì)分析中引用的參考毒株信息見(jiàn)表1。

表1 序列比對(duì)分析中引用的國(guó)內(nèi)外CSFV 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 E2 及5'NTR 基因序列比對(duì)

2.1.1E2基因使用MEGA6.0 軟件，將2 株野豬源CSFV 毒株E2基因與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的代表毒株進(jìn)行序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示：2 株野豬源CSFV 同源性為87.2%，與國(guó)內(nèi)外參考毒株同源性分別為81.2%～94.6%（YNPEwildboar3180919）、81.0～97.6%（YNPEwildboar4180919），與我國(guó)2012 年河南毒株（CSFVHNYY2012）、2001 年臺(tái)灣毒株（CSFVTWN040601）同源關(guān)系比較近，同源性分別為88.3%～94.6%（YNPEwildboar3180919）、89.8%～97.6%（YNPEwildboar4180919）；與我國(guó)強(qiáng)毒株Shimen 株（CSFVShimenHVRI）同源性較低，同源性分別為82.0%（YNPEwildboar3180919）、81.2%（YNPEwildboar4180919）。系統(tǒng)發(fā) 育 分析結(jié)果（圖1）顯示：所測(cè)的2 株野豬源毒株均屬于基因2.1 亞型。氨基酸序列分析結(jié)果（表2）顯示：YNPEwildboar3180919 分離毒株與我國(guó)2.1d 亞型CSFV 蛋白相比，有6 個(gè)相同的突變特征（R31、S34、W182、K205、K303、A331）；而YNPEwildboar4180919 毒株前4 個(gè)氨基酸與YNPEwildboar3180919 相同，但在R303、V331這2 個(gè)氨基酸上具有2.1b 亞型毒株特征，其可能是2.1b 向2.1d 亞型演化的中間毒株，這與2020 年許滸等[14]的研究結(jié)果一致。

表2 CSFV E2 基因編碼氨基酸變異位點(diǎn)比對(duì)分析結(jié)果

圖1 CSFV E2 基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

2.1.2 5'NTR 基因 將測(cè)得的2 株野豬源CSFV毒株5'NTR 基因與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的毒株序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩毒株間的同源性為100%，與國(guó)內(nèi)外參考毒株的同源性為93.6%～98.5%，其中與中國(guó)強(qiáng)毒株Shimen 株（CSFVShimenHVRI）同源性為95.6%，與Brescia 株（CSFVBRESCIAX2001）同源性為96.3%，與我國(guó)2006 年陜西毒株（CSFVSXYL2006）、2001 年臺(tái)灣毒株（CSFVTWN040601）同源關(guān)系較近，同源性分別為97.8%、98.5%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖2）顯示，該2 株CSFV 毒株5'NTR 基因均屬于2.3 亞型。

圖2 CSFV 5'NTR 基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

3 討論

CSF 作為嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一，歷來(lái)備受關(guān)注。自20 世紀(jì)50 年代CSFV 兔化弱毒疫苗在我國(guó)被廣泛使用后，CSF 得到了有效控制。但隨著2017 年CSF、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征退出強(qiáng)制免疫，CSF 在云南省多地時(shí)有發(fā)生，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了不同程度的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究所測(cè)2 個(gè)毒株E2基因?qū)儆?.1 亞型，與Shimen 株同源性只有81.2%～82.0%，可見(jiàn)CSFV 的E2基因從分子程度上在向遠(yuǎn)離Shimen 株方向發(fā)展，其中一株具有2.1d 亞型變異特征，另一株與2.1d 亞型略有差異，介于2.1b 與2.1d 亞型分支之間，可能是2.1b向2.1d亞型演化的中間毒株。Van Rijn 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，E2 蛋白的氨基酸序列中含有15 個(gè)較為保守的半胱氨酸（Cys）殘基，其中位于E2 蛋白N 末端的6 個(gè)Cys 殘基（4、48、103、120、139、167 位氨基酸處），對(duì)E2 蛋白特異性抗原決定簇的形成及其結(jié)構(gòu)的正確折疊起著重要作用。本研究中的2 個(gè)CSFV 毒株序列在這些位點(diǎn)上均未發(fā)生變異，與許滸等[14]近年的研究結(jié)果相同，說(shuō)明所測(cè)毒株與我國(guó)近年來(lái)流行毒株一樣，雖存在一定的遺傳衍化，但總體比較穩(wěn)定。所測(cè)毒株5'NTR 基因?qū)儆?.3 亞型，與Shimen 株的同源性高達(dá)95%以上，所測(cè)毒株是否是由不同毒株重組而來(lái)的，這有待于進(jìn)一步研究確定。此次研究未將云南省野豬源毒株與家豬源病毒株進(jìn)行比較，有待后續(xù)進(jìn)一步研究探索。

野豬源CSFV 基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析在國(guó)外文獻(xiàn)中多有報(bào)道[16]，但在我國(guó)尚少見(jiàn)。本研究盡管受試驗(yàn)條件、樣品數(shù)量等的限制，未能進(jìn)一步研究基因變異與病毒致病性關(guān)系等問(wèn)題，但也為CSF 防控提供了分子流行病學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步做好分子變異等研究奠定了基礎(chǔ)。