何世成，王紫微，2，王 成，胡巧云，唐小明，王衛(wèi)國，謝怡靈，王昌建

（1.湖南省動物疫病預防控制中心，湖南長沙 410014；2.衡陽技師學院，湖南衡陽 421101；3.湘西州動物疫病預防控制中心，湖南吉首 416000）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，其表面無囊膜包裹，呈二十面體對稱，直徑為13～25 nm，具有環(huán)狀單股負鏈DNA 基因組，是最小的動物病毒之一[1]。PCV 按致病性、抗原特異性可分為豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3）及豬圓環(huán)病毒4 型（PCV4）[2]。PCV1 發(fā)現較早，于1974 年在豬腎細胞中被發(fā)現[3]，但該病毒不會造成豬細胞病變。20 世紀90 年代后期發(fā)現PCV2[4]，2016 年發(fā)現PCV3[5]，2019 年發(fā)現PCV4[2]。但隨后發(fā)現的這些基因型病毒對豬均具有嚴重致病性。目前普遍認為PCV1 對豬無致病性。也有研究[6]證明PCV1 體外感染能對豬肺泡巨噬細胞的功能產生影響，但時間較短。此外還發(fā)現，PCV1 可以在55 日胎齡接種的豬胎兒肺中有效復制，并對豬胎兒的肺部造成以嚴重出血為特征的微觀病變[7]。

PCV1 基因組全長1 758、1 759 或1 760 bp，包括11 個潛在閱讀框（open reading frames，ORF），主要是ORF1 和ORF2。ORF1 的主要功能是編碼與病毒復制相關的蛋白（Rep 蛋白），被認為是PCV 基因組中最保守的區(qū)域；ORF2 的主要功能是編碼病毒衣殼蛋白（Cap 蛋白，由233～234個氨基酸組成[8]）。為了解湖南省的PCV1 遺傳變異情況，本研究對從豬場病料和屠宰場中檢測到的病毒序列進行了遺傳進化分析。

1 材料與方法

1.1 材料

在湖南省821 份臨床病料和屠宰場豬淋巴結樣品中，選取16 份PCV1 陽性（Ct ≤30）的樣品核酸。

1.2 主要試劑和設備

2×TaqMaster Mix，購自安諾論生物科技有限公司；50×TAE 緩沖液，購自北京索萊寶科技有限公司；Agarose，購自BIOWEST；Super GelRed核酸凝膠染料10 000×，購自蘇州宇恒生物科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker 和DNA 凝膠回收試劑盒，購自東盛生物科技有限公司；PCR 擴增儀，購自西安天隆科技有限公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，購自北京六一儀器廠；紫外凝膠成像儀，購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3 引物設計

PCV1 全基因擴增引物對P1 和P2，根據GenBank 數據庫中下載的PCV1 全基因序列，用Primer Premier 5 軟件設計，引物信息見表1。

表1 PCV1 全基因PCR 擴增引物信息

1.4 全基因組擴增及測序

反應總體系為25.0 μL：無菌無核酸酶水7.5 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA 模板3.0 μL。

PCV 擴增反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性20 s，63 ℃（P1）/64 ℃（P2）退火30 s，72 ℃延伸1 min，共37 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

反應完成后取5.0 μL 擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳35 min，紫外凝膠成像儀中觀察結果、拍照。陽性條帶切膠回收后編號，送擎科生物有限公司進行雙向測序。

1.5 遺傳進化分析

將同一編號的4 個不同測序結果，通過DNAstar 中的SeqMan 軟件進行拼接獲得全基因序列，利用NCBI 的BLAST 進行比對分析，選取國內外16 株PCV1 序列（表2）作為參考。

表2 PCV1 參考序列

全基因及ORF2 核苷酸序列同源性，利用DNAstar 中的MegAlign 軟件進行比對；系統遺傳進化樹，使用MEGA-X64 生物軟件繪制，通過軟件中的Clustal W 法進行比對；構建進化樹時，采用Neighbor-Joining 法；Cap 蛋白氨基酸序列，用MegAlign 軟件Clustal W 法進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 全基因組擴增

使用P1、P2 引物，對PCV1 檢測結果為陽性的樣品進行全基因組擴增，成功擴增出亮帶，產物與預期片段一致（圖1），分別為1 046 和1 198 bp。共擴增獲得5 株PCV1 全基因組（表3），其中3株全基因大小為1 759 bp，另外2 株大小分別為1 758、1 760 bp（PCV1-HN137-2018 在994 位 點缺失A或G，PCV1-HY577-2020在994位點增加T）。

圖1 PCV1 全基因組的擴增結果

表3 PCV1 分離株的來源信息

2.2 遺傳進化分析

對本試驗獲得的5 株PCV1 全基因組與國內外上傳至GenBank 中的16 株PCV1 全基因組序列及ORF2 序列，使用MEGA-X64 生物軟件繪制系統遺傳進化樹。

從PCV1 全基因組序列系統遺傳進化樹（圖2）中可看出，PCV1-HH95-2018、PCV1-HY553-2020、PCV1-HN137-2018 和PCV1-YY854-20204 位于同一大分支中，與大部分國外PCV1 分離株分屬于兩大分支。

圖2 PCV1 全基因組遺傳進化樹

從ORF2序列系統遺傳進化樹（圖3）可以看出，本研究所獲得的5 株PCV1 ORF2 序列在均在同一大的分支中，與大多數國外PCV1 分離株ORF2 序列分列在兩個大的分支中，與多株廣西參考株親緣關系較近。

圖3 PCV1 ORF2 遺傳進化樹

較為特別的是PCV1-HY577-2020，在全基因進化樹中單獨屬于一個分支，但在ORF2 進化樹中與本研究中的其他分離株均在同一分支中，說明PCV1-HY577-2020 存在一定程度變異，但ORF2序列突變不明顯。

2.3 同源性分析

對本研究獲得的5 株PCV1 全基因組及國內外上傳至GenBank 中的16 株PCV1 全基因組序列進行同源性分析和ORF2 序列同源性分析，發(fā)現本研究獲得的5 株PCV1 全基因組同源性為98.4%～99.7%（圖4），與國內外的PCV1 全基因組同源性為98.1%～99.7%。本研究獲得的PCV1-HH95-2018 與PXC1-HY553-2020 同源性 最 高（99.7%），與其同源性最高的分離株為2015 年國內分離的GXbb158（KX827782.1）分離株（99.4%）。而同源性最低的是PCV1-HY577-2020，與2006 年哈爾濱分離株PCV1/G（JN398656.1）同源性為98.1%。

圖4 PCV1 全基因組核苷酸序列同源性比較結果

本研究獲得的5 株PCV1ORF2 序列同源性為97.6%～99.6%（圖5），與國內外的PCV1 ORF2 同源性為96.9%～99.9%。其中本研究獲得的PCV1-HH95-2018 與國內2015 年分離的GXbb158（KX827782.1）同源性最高（99.9%），而同源性最低的是PCV1-HY577-2020 與國外2015 年匈牙利的Szeged（KX816645.1）分離株和國內2006 年哈爾濱分離株PCV1/G（JN398656.1），同源性為96.9%。

圖5 PCV1 ORF2 核苷酸序列同源性比較結果

2.4 ORF2 氨基酸序列比對

本研究獲得的5 株PCV1 ORF2 序列翻譯的Cap 蛋白均由233 個氨基酸組成。PCV1 ORF2 氨基酸序列比對結果見圖6。從比對結果可以看出，PCV1 ORF2 氨基酸中的第53、63、69、116 和176 位氨基酸具有明顯的突變。英國、美國、匈牙利和澳大利亞分離株的這幾個位點都與國內分離株不同，說明國內外的PCV1 ORF2 氨基酸存在差異。此外，還存在部分分離株單一位點的突變。

圖6 PCV1 ORF2 氨基酸序列比對結果

本研究獲得的5 株PCV1 中，PCV1-HN137-2018、PCV1-HY577-2020 和PCV1-YY854-2020 與其他參考分離株相比，無明顯差異，未發(fā)現突變。而PCV1-HH95-2018 和PCV1-HY553-2020 在第116 位氨基酸與其他分離株存在差異，其中PCV1-HH95-2018 在第133 位氨基酸由P 變?yōu)門。

3 討論

PCV1 在1974 年被發(fā)現并證實不會造成豬細胞病變，對豬無致病性。另一方面PCV1 與PCV2基因組結構相似，又具有Rep 蛋白存在抗原交叉而Cap 蛋白不存在抗原交叉的特性[9]。因此，常在研制嵌合病毒疫苗時以PCV1 作為載體，構建存在PCV2 ORF2 基因的嵌合病毒[10-11]。但也有研究[8]發(fā)現，PCV1 對豬胎兒肺部可造成以嚴重出血為特征的微觀病變，可能對仔豬免疫系統具有潛在危害。2008—2015 年國內不同地區(qū)的PCV1 陽性檢出率為6.39%～34.00%[12-15]。

本研究獲得5 株PCV1 全基因組，其中2 株在994 位點存在核苷酸缺失或增加。該位點位于P1 引物5'的100 位點后，測序結果較為準確，測序波峰清晰，波距均勻且無雜峰，因此認為測序結果置信，證實該位點發(fā)生了基因變異。但994 位點不在ORF1 和ORF2 中，因此對氨基酸序列無影響。涂偉[14]首次報道出現不同長度片段的PCV1 全基因組。系統發(fā)育樹顯示，本研究獲得的5 株PCV1均屬于同一分支，并顯示出一定的地理差異，與多株廣西參考株親緣關系較近，但差異較小，同源性均在97.6%以上。王偉丞等[16]、涂偉[14]研究獲得的PCV1 分離株全基因同源性均大于98%，與本研究結果相似，表明國內外PCV1 分離株較為保守。

PCV1 氨基酸經比對顯示出地理差異，國內與國外分離株的部分氨基酸位點存在明顯差異。本研究獲得的PCV1 僅在第133 位氨基酸位點存在一個與參考分離株不同的氨基酸。而2015 年廣西省擴增的13 株PCV1 分離株共存在6 個與參考分離株不同的氨基酸突變，但在遺傳進化樹中處于同一分支[15]，說明盡管PCV1 ORF2 氨基酸存在點突變，但是未進化出不同的PCV1 亞型，具有較為穩(wěn)定的特質。

綜上所述，湖南省流行的PCV1 毒株基因穩(wěn)定性較高，分離株間差異較小。本研究成功擴增測序了5 株PCV1 全基因組，為湖南省豬圓環(huán)病毒病防控及相關研究奠定了基礎。